【摘 要】
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目的:朊病毒疾病是一类由朊蛋白错误折叠引起的致命性神经退行性疾病,其主要病因为朊蛋白错误折叠形成的具有蛋白酶K抗性的构象体PrpSc导致的中枢神经系统的损伤。但是朊蛋白
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目的:朊病毒疾病是一类由朊蛋白错误折叠引起的致命性神经退行性疾病,其主要病因为朊蛋白错误折叠形成的具有蛋白酶K抗性的构象体PrpSc导致的中枢神经系统的损伤。但是朊蛋白构象转变的具体机制尚不明确。我们认为朊蛋白N端23-28位氨基酸可能影响朊蛋白的构象转变。基于这一假设,我们试图构建一系列改变朊蛋白N端生化特性的突变体,在体外重组表达,通过蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)技术研究朊蛋白N端突变对朊蛋白构象转变的影响。方法:我们通过定点突变,从改变朊蛋白N端正电荷的数量、改变朊蛋白N端氨基酸序列和朊蛋白N端脯氨酸的位置三个方面设计引物,使用突变引物进行PCR获得突变体朊蛋白基因,经测序无误后,将突变体基因连接到表达载体上。用获得的连接有突变体朊蛋白基因的表达载体转化感受态细胞,在体外用大肠杆菌表达3种有代表性的突变体朊蛋白。利用体外重组表达获得的突变体朊蛋白进行PMCA实验,观察PrPSc在突变体朊蛋白中的扩增情况,并与野生型朊蛋白的PMCA实验结果进行比较。结果:成功构建了6种突变体朊蛋白基因,分别为N端缺失的Del-N6, N端长度不变,正电荷数量为0的Met 4-1, N端氨基酸序列改变的Res1, Res2, Res3和Res4。经测序,6种突变体基因序列正确。成功将6种突变体基因连接于pET-22b表达载体上。取其中三种,Del-N6, Met 4-1和Res1,转化感受态大肠杆菌,在体外利用IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化获得可以用于蛋白质错误折叠循环扩增实验的野生型和突变体朊蛋白。在体外条件下利用获得的突变体朊蛋白,辅以RNA、POPG等辅助因子,进行PMCA实验,经蛋白酶K酶切检测发现,PrpSc在诱导野生型朊蛋白发生构象转变的同时,也可以诱导Del-N6和Met 4-1两种突变体朊蛋白发生构象转变。结论:PMCA实验结果显示,在成分清楚的情况下,原核表达的突变体朊蛋白与野生型朊蛋白在PrPsc诱导的构象转变上没有显著差异。这一结果与动物实验结果以及其他利用真核表达的朊蛋白开展的实验不同,其原因有可能是真核表达的朊蛋白C端多带的糖基是朊蛋白构象转变的重要影响因子,糖基的存在可能影响到朊蛋白N端在朊蛋白构象转变过程中的效应。以往我们普遍认为,RNA和脂质是影响朊蛋白构象转变最重要的因素,我们的结果提示我们,动物中枢神经系统中可能存在其他成分影响这一过程,并且这一未知成分的影响与朊蛋白N端有关。
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