【摘 要】
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替加环素作为半合成的广谱甘氨酰环肽类抗生素,是目前已知的治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,但新型替加环素耐药基因的出现和传播严重威胁着替加环素的疗效,对全球公共卫生构成严重挑战。最近,在动物源及人源肺炎克雷伯菌中发现的质粒介导的RND型外排泵基因簇tmexCD1-toprJ1,能够降低包括替加环素在内的多种抗菌药物的敏感性。但针对该新型耐药基因的流行病学及基因组学特征,还没有系统的研
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目“规模猪场养殖环境中耐药质粒多态性及转移机制研究”(编号:31872523); 人社部高层次留学回国人才回国资助项目;
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替加环素作为半合成的广谱甘氨酰环肽类抗生素,是目前已知的治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,但新型替加环素耐药基因的出现和传播严重威胁着替加环素的疗效,对全球公共卫生构成严重挑战。最近,在动物源及人源肺炎克雷伯菌中发现的质粒介导的RND型外排泵基因簇tmexCD1-toprJ1,能够降低包括替加环素在内的多种抗菌药物的敏感性。但针对该新型耐药基因的流行病学及基因组学特征,还没有系统的研究。此外,tet(A)基因突变也是降低替加环素敏感性的重要机制。因此,本文主要探究RND型外排泵基因簇tmexCD-toprJ和MFS外排泵基因tet(A)变体在猪肉生产链中(养殖场-屠宰场-零售猪肉)对替加环素耐药性形成的作用,并阐明其流行情况及传播机制。首先,我们从猪肉生产链条(养殖场、屠宰场和市场)的682份样品中鉴定出25株tmexCD-toprJ阳性菌株,发现tmexCD-toprJ阳性菌株在屠宰场最常见(7.32%)。大多数tmexCD-toprJ阳性菌株为肺炎克雷伯菌(23/25),少数为奇异变形杆菌(2/25)。随后我们又在上述屠宰场382份样品中分离到45株tet(X)、tmexCD-toprJ阴性的替加环素耐药菌株(MIC为4-16 mg/L),较高的MIC可能是tet(A)突变和ramR、oqxR失活等多种替加环素耐药机制共同作用的结果。总计检测到3种tet(A)变体,3型tet(A)变体为本研究鉴定的新型变体。随后,我们着重分析了 25株tmexCD-toprJ阳性菌株的基因组学特征,结果显示23株肺炎克雷伯菌携带的tmexCD1-toprJ1基因簇位于其质粒上,我们在另外2株奇异变形杆菌染色体的ICE结构上首次发现了tmexCD3-toprJ3变体。同时基于MinION三代纳米孔单分子测序技术获得5个完整的tmexCD1-toprJ1阳性质粒的精细图谱,其多重耐药区存在显著差异,此外多个质粒中存在tmexCD1-toprJ1的多拷贝现象,而tmexCD1-toprJ1拷贝数和多药耐药区的多变性导致了 tmexCD1-toprJ1阳性质粒的多样性。本研究所有tmexCD1-toprJ1阳性质粒分为两种类型:IncFIB(Mar)/IncHI1B杂合型质粒(20株)和IncR型质粒(3株)。IncFIB(Mar)/IncHI1B杂合型质粒是介导该外排泵基因簇tmexCD-toprJ在病原菌尤其是在肺炎克雷伯菌中传播的关键载体。此外我们发现在多个tmexCD1-toprJ1阳性质粒中存在包含tmexCD1-toprJ1基因簇的可转移单元,有研究报道该结构能够促进耐药基因的动员。遗传环境分析发现tmexCD1-toprJ1基因环境具有保守性,umuC基因是该基因簇的潜在插入位点。传代进化试验结果表明替加环素压力下传代可以提高菌株对替加环素的耐药水平,增加tmexCD1-toprJ1基因簇的表达量,同时富集tmexCD1-toprJ1基因的拷贝数。最后,为了探究tmexCD-toprJ基因簇在肺炎克雷伯菌中高流行率的原因,我们依照生长曲线、体外竞争、生物膜形成能力等一系列指标来评估pUC19-tmexCD-toprJ重组质粒在不同宿主菌中的适应性代价。结果发现,tmexCD-toprJ基因簇在大肠杆菌中表现出极高的适应性代价,而在肺炎克雷伯菌中无明显适应性代价,表明该基因簇在肺炎克雷伯菌中的高流行率与其较低的适应性代价相关。综上,本研究阐明了猪源肺炎克雷伯菌中替加环素耐药基因tmexCD-toprJ和tet(A)变体的流行特征及传播机制,并从适应性代价层面解释了tmexCD-toprJ基因簇的流行规律,丰富了tmexCD-toprJ基因簇的流行病学和基因组学特征,为预防tmexCD-toprJ基因簇的流行提供了理论依据。由于替加环素禁止应用于兽医临床,传统四环素类药物在tmexCD-toprJ和tet(A)突变体形成中的促进作用有待进一步探索。
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