皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)是一组异质性的T淋巴细胞来源的非霍奇金淋巴瘤,蕈样肉芽肿(MF)和Sezary Syndome综合征(SZS)是其最常见的两种类型。CTCL的病因及发病机制复杂多样。一方面,CTCL的疾病过程中存在明显免疫抑制特点,Th1细胞因子、Th2细胞因子及调节性T细胞(Treg)细胞因子分泌失衡的微环境有利于恶性T细胞的增殖,使其活力增强。另一方面,恶性T细胞对凋亡耐受,机体清除异常细胞能力降低为肿瘤形成创造了条件。CTCL的治疗方法多样,近年来多项临床研究报道维A酸类化合物治疗CTCL有效且是CTCL各阶段治疗中外用或口服,单用或联合治疗的首选药物。维A酸类化合物属于维生素A衍生物,包括天然维生素A、其代谢物及合成类似物,具有调控多种细胞生物过程的作用,包括胚胎发育、视力、生殖、骨骼形成及细胞增殖、凋亡、分化及恶性转化等。维A酸类化合物常用于多种肿瘤的治疗,尤其在血液肿瘤中疗效确切。全反式维A酸(ATRA)治疗急性粒细胞性白血病(APL)有效率为40%-90%。体内外实验研究证实维A酸类药物均通过维A酸受体进行基因转录从而抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。但维A酸类药物治疗过程中存在的多种不良反应及药物耐受也与维A酸受体相关,这很大程度限制了维A酸类化合物在临床中的应用。ECPIRM是本实验室合成的新维A酸衍生物,具有抑制皮肤鳞癌细胞SCL-1增殖,促进SCL-1凋亡、诱导SCL-1分化为正常或接近正常细胞的作用,同时对小鼠皮肤刺激作用明显弱于ATRA。在对SCL-1的作用中,ECPIRM的作用特点有别于传统维A酸类药物,其不依赖于维A酸受体。由于维A酸类化合物的不良反应及耐药均与维A酸受体有关,因此推测ECPIRM在不良反应及耐药性方面要优于传统维A酸类药物,具有潜在的临床应用前景。由于ECPIRM在皮肤鳞癌细胞的研究结果体现了其自身的治疗优势,本研究拟探讨其在淋巴瘤细胞中的作用、分子机制及其生物学效应与维A酸受体的关系。HUT78细胞来源于SZS,属于恶性T细胞,具有T细胞的特点。与以往研究的SCL-1细胞不同,SCL-1细胞表达的维A酸受体主要为维A酸受体α(RARα)及维A酸受体γ(RARγ),而T细胞表达了除维A酸X受体γ(RXRγ)以外的所有维A酸受体,可见两者在来源、性状等方面的差异显著,故本实验以HUT78细胞为研究对象。具体研究内容分为三个部分:1)ECPIRM对CTCL细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及其作用机制探讨;2)ECPIRM对CTCL细胞HUT78免疫调节的作用及其作用机制探讨;3)ECPIRM对CTCL细胞HUT78表达的维A酸受体活性的影响。第一部分ECPIRM对CTCL细胞HUT78增殖、凋亡、细胞周期的影响及作用机制研究目的观察新维A酸化合物ECPIRM对CTCL细胞的增殖、凋亡及细胞周期生物学效应,并探讨其作用机制,为ECPIRM的成药性提供依据。1、ECPIRM对CTCL细胞增殖的影响方法用MTT法、台盼蓝拒染法检测浓度为5μM、1OμM、20μM和40μM的ECPIRM分别作用HUT78细胞、Myla细胞(初始浓度:3.5×104)及正常人淋巴细胞(初始浓度:5.0×104)24h、48h、72h及96h后对其增殖的影响。并对比ECPIRM、ATRA、13-cisRA和贝扎罗汀对HUT78细胞增殖作用影响。结果(1)ECPIRM明显抑制HUT78细胞增殖活性:实验显示40μM的ECPIRM作用24h后,HUT78细胞增殖被明显抑制,作用48h后,10μM及以上浓度ECPIRM明显抑制HUT78细胞增殖,抑制率在96h达最高峰(P<0.01)。与传统维A酸相比,HUT78细胞增殖的作用,明显强于等摩尔浓度的贝扎罗汀。20μM及以上浓度的ECPIRM对HUT78细胞增殖抑制作用显著强于等摩尔浓度的ATRA及13-cis RA。(2)ECPIRM明显抑制Myla细胞增殖活性:实验显示20μM的ECPIRM作用72h后明显抑制Myla细胞增殖,40μM的ECPIRM作用后抑制率增加,作用96h后抑制率最大(P<0.01)。(3)ECPIRM对于正常人淋巴细胞增殖活性影响:实验显示5μM、10μM、20μM和40μM的ECPIRM作用正常人淋巴细胞24h、48h、72h及96h后对正常人淋巴细胞增殖最大抑制率为8.37。结论ECPIRM显著抑制CTCL细胞HUT78及Myla的增殖。对正常人淋巴细胞增殖无明显影响。2、ECPIRM对CTCL细胞凋亡的影响方法(1)利用荧光显微镜观察浓度分别为5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78细胞24h、48h及72h后,HUT78细胞的形态变化。用相同的方法处理HUT78细胞及正常人淋巴细胞后,采用流式细胞术(AnnexinV/PI双染法)检测凋亡率。(2)利用流式细胞术(PI染色)检测浓度分别为5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78细胞24h、48h及72h后,HUT78细胞的周期分布变化。(3)用 western blot 检测浓度分别为 5μM、10μM 和 20μM 的 ECPIRM 作用 HUT78细胞72h后增殖、凋亡蛋白(BCL-xl、c-myc)表达的变化。结果(1)ECPIRM明显诱导HUT78细胞凋亡:显微镜观察ECPIRM作用后HUT78细胞的形态变化,与未处理的HUT78细胞相比,作用24h后,HUT78细胞形态无明显改变;作用48h后,可观察到ECPIRM处理后的细胞数量较未处理细胞稀疏,有部分凋亡细胞及细胞核碎片。作用72h后,可见更多浓缩的细胞核,细胞碎片及凋亡小体流式细胞术检测不同浓度ECPIRM作用HUT78细胞24h、48h及72h后,对HUT78细胞凋亡的影响。结果作用24h后,HUT78细胞凋亡不明显。作用48h后,HUT78细胞凋亡明显增加(P<0.01),作用72h后,20μM的ECPIRM促进75.04%的HUT78细胞凋亡。对正常人淋巴细胞凋亡的研究结果表明ECPIRM对其影响不明显。(2)ECPIRM明显细胞增殖及凋亡蛋白表达:western bolt法检测ECPIRM对细胞增殖及凋亡蛋白表达影响。结果表明BCL-xl和c-myc的相对表达量均随着ECPIRM浓度的增加而逐渐降低(p<0.01)。结论ECPIRM具有明显促进HUT78细胞凋亡的作用,对正常人淋巴细胞凋亡无明显影响。ECPIRM的增殖、凋亡作用通过抑制BCL-xl和c-myc表达实现。3、ECPIRM对CTCL细胞细胞周期的影响方法(1)利用流式细胞术(PI染色)检测浓度分别为5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78细胞24h、48h及72h后,HUT78细胞的周期分布变化。(2)用western blot检测浓度分别为5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78细胞72h后细胞周期蛋白(Cyclin)、周期蛋白依赖激酶(CDK)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)表达的变化。结果(1)ECPIRM具有明显阻滞HUT78细胞的细胞周期作用:流式细胞术检测ECPIRM对HUT78细胞细胞周期的影响。作用24h后,ECPIRM对HUT78细胞的细胞周期无影响。作用48h后G0/G1期的细胞比率随浓度增加而递增(P<0.01)。作用72h后,HUT78细胞G0/G1期比率最大达71.70±2.48。S期和G2/M期的百分比则相应降低。(2)ECPIRM影响细胞周期相关蛋白表达western bolt法检测ECPIRM对细胞周期相关蛋白表达影响。结果表明CDK2、CDK4、CyclinD1和CyclinE的相对表达量均随着ECPIRM浓度的增加而逐渐降低(P<0.01),p21及p27的相对表达量则随着药物浓度的增加而逐渐增加(P<0.01)。结论ECPIRM通过影响细胞周期蛋白使HUT78细胞周期阻滞于G0/G1期。4、ECPIRM抑制JAK/STAT通路活性方法用western blot检测浓度分别为5μM、10μM和20μM的ECPIRM作用HUT78细胞72h后,JAK/STAT通路蛋白变化。结果通过westernblot检测JAK/STAT通路蛋白的表达变化,结果表明JAK1、STAT3 及 STAT5 表达无变化,pJAK1、pSTAT3 及 pSTAT5 表达量随 ECPIRM剂量增大逐渐下降。结论 ECPIRM具有抑制JAK/STAT通路活性的作用,推测ECPIRM对HUT78细胞增殖抑制、促凋亡及周期改变与此相关。第二部分ECPIRM对CTCL细胞免疫调节作用及机制研究目的探讨新维A酸化合物ECPIRM对CTCL细胞的免疫调节作用,并探讨其可能的作用机制。1、ECPIRM对CTCL细胞免疫调节的浓度选择方法用MTT法检测浓度分别为0.01μM、0.1μM、11μM和10μM的ECPIRM作用HUT78细胞(初始浓度5×104)24h、48h、72h及96h后对其增殖的影响结果浓度分别为0.01μM、0.11μM及1μM的ECPIRM分别作用24h、48h、72h及96h后均不能明显抑制HUT78细胞的增殖,10μM的ECPIRM作用HUT78细胞48h后明显抑制HUT78细胞增殖。结论本实验可选择0.01μM、0.1μM及1μM的ECPIRM作用HUT78细胞96h为后续试验的条件。2、ECPIRM对CTCL细胞免疫调节的影响方法用RT-qPCR及流式细胞术检测浓度分别为0.01μM、0.1μM和1μM的ECPIRM 作用 HUT78 细胞 96h 后,对 IL-2、IL-12、IFGγ、IL-4、IL-5、IL-10 及TGF-β表达变化结果(1)RT-qPCR 结果表明 IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4 和 IL-5 在 HUT78 细胞中表达量低。ECPIRM可低水平增加IL-2、IL-12及IFN-γ的mRNA水平,明显降低IL-10及TGF-β的mRNA水平,对IL-4和IL-5无影响。(2)流式细胞术检测 ECPIRM 对 IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10 及TGF-β的蛋白水平变化,其结果与RT-qPCR结果一致。结论 ECPIRM可通过降低IL-10及TGF-β表达来调节CTCL细胞的免疫。3、ECPIRM对CTCL细胞免疫调节作用机制的初步探讨方法用RT-qPCR及western bolt法检测浓度分别为0.01 μM、0.1 μM和1 μM的ECPIRM作用HUT78细胞96h后,对NF-KB通路P65及IkBα的mRNA水平变化及P65、IkBα及pIkBα蛋白表达变化。结果 RT-qPCR结果显示1μM的ECPIRM作用后P65及IkBα的mRNA水平明显下降。P65和IkBα蛋白表达变化与mRNA水平一致,pIkBα蛋白表达水平随ECPIRM作用逐渐下降,具有剂量依赖性。结论 ECPIRM能抑制NF-KB通路活性。NFKB通路活性被抑制是ECPIRM抑制IL-10及TGF-β分泌的机制之一。第三部分ECPIRM对HUT78细胞表达的维A酸受体活性的影响目的探讨ECPIRM对T细胞淋巴瘤细胞表达的维A酸受体的影响。1、ECPIRM对维A酸类受体及其下游基因mRNA水平和蛋白水平表达的影响方法利用RT-qPCR和western blot分别检测浓度为0.1μM、1μM和10μM的ECPIRM和ATRA作用HUT78细胞96h后,其表达的RAR、RXR及下游基因他扎罗汀诱导基因1(TIGI),细胞色素P450家族成员26A1(CYP26A1)和STAT1的mRNA水平及CYP26A1、STAT1及TIGI蛋白表达变化。结果 ECPIRM 对 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ 及其下游基因 CYP26A1、TIG1和STAT1蛋白和mRNA均无明显影响。而阳性对照药ATRA可明显增加RARα、TIG1、CYP26A1及STAT1蛋白和mRNA水平的表达。结论在HUT78细胞中,ECPIRM不激活维A酸受体信号通路。2、比较维A酸受体抑制剂ECPIRM、ATRA及贝扎罗汀单用及联合维A酸类受体抑制剂对HUT78细胞增殖的影响。方法(1)用MTT法比较单用浓度为0.1μM、1μM和10μM的ECPIRM、ATRA及0.1μM、1μM 和 10μM 的 ECPIRM、ATRA 联合 1μM 或 10μM 的 AGN193109 作用HUT78细胞24、48、72及96h后,四组药物对HUT78细胞的增殖抑制作用,并比较四组药物作用24h及96h后的IC50。(2)用MTT法比较单用浓度为0.1μM、1μM和10μM的ECPIRM、贝扎罗汀及O.1μM、1μM和10μM的ECPIRM、贝扎罗汀联合1μM或10μM的单蒽醌作用HUT78细胞24、48、72及96h后,四组药物对HUT78细胞的增殖抑制作用并比较四组药物作用24h及96h后的IC50。结果维A酸RAR拮抗剂(AGN193109)及维A酸RXR拮抗剂(单蒽醌)均不影响ECPIRM对HUT78细胞的增殖活性;而维A酸RAR拮抗剂(AGN193109)明显影响维A酸RAR激动剂ATRA对HUT78细胞的增殖抑制作用;维A酸RXR拮抗剂明显影响维A酸RXR选择剂贝扎罗汀对HUT78细胞的增殖抑制作用。结论ECPIEM对HUT78细胞增殖的抑制作用均不受维A酸受体抑制剂的影响。进一步表明,ECPIRM对HUT78细胞增值的抑制是非维A酸受体途径的。小结1、ECPIRM对CTCL细胞HUT78具有明确的抑制增殖、促进凋亡和阻滞细胞周期的作用,其对HUT78细胞增殖抑制作用显著优于ATRA、13-cisRA及贝扎罗汀(p<0.01)。同时,ECPIRM对正常人淋巴细胞无明显抑制增殖及促进凋亡的作用。2、ECPIRM具有阻滞CTCL细胞HUT78于G0/G1期的作用,其机制通过增加p21和p27的蛋白表达,抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2及CDK4的蛋白表达,抑制细胞由G1期向S期转化。3、ECPIRM促进HUT78细胞凋亡,发生G0/G1期的阻滞可能与JAK/STAT通路被抑制有关。4、ECPIRM具有调节恶性T细胞分泌Th1/Th2细胞因子的作用,其机制与抑制NF-KB通路活性有关。5、ECPIRM 不影响 HUT78 细胞 RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ 及其下游基因CYP26A1、STAT1、TIGI的表达,其对HUT78细胞的抗增殖作用也不受维A酸受体抑制剂的影响。表明ECPIRM对HUT78的生物学效应是非维A酸受体途径依赖。推测ECPIRM在肿瘤治疗中可能具有一定治疗学优势。