论文部分内容阅读
目的：以63种中药醇提物为研究对象，尝试筛选出其中能够抑制转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的上皮细胞向间质细胞转化(EMT)过程的醇提物，并寻找其中可能起效的活性产物。探讨这些活性产物抑制TGF-β1诱导的EMT过程的作用机制，以及其对A549细胞株的生长情况及EMT分子标志蛋白上皮-钙黏素(E-cadhein)及波形蛋白(vimentin)表达的影响。为治疗非小细胞肺癌的新药开发及中医临床用药提供扎实的实验基础及理论依据。 方法：1、建立TGF-β1诱导非小细胞肺癌细胞株A549发生EMT过程的模型。2、MTT法找到63种中药醇提物处理A549细胞的最佳剂量，然后将63种中药醇提物分别以最佳剂量干预TGF-β1诱导EMT的A549细胞，48h后，通过倒置相差显微镜观察每组细胞的形态变化，并通过western blot法检测此63种中药醇提物对TGF-β1介导的A549细胞发生的EMT的相关分子标志蛋白E-cadhein和vimentin的表达。3、对筛选出的能够抑制TGF-β1诱导非小细胞肺癌细胞株A549发生的EMT过程模型的6种醇提物中的两种（何首乌和粉防己）分别进行研究，并挑选何首乌中的2种主要活性成分（何首乌苷、二苯乙烯苷）及防己中的2种活性成分（粉防己碱、防己诺林碱）进行机制研究，先用MTT法找出这4种活性成分的合适剂量后，通过western blot法检测与TGF-β1诱导的A549细胞的EMT过程相关的分子标志蛋白E-cadhein和vimentin的表达，并检测与TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程相关的信号传导途径相关的蛋白smad2、p-smad2、Erk1/2及p-Erk1/2的表达。研究其影响EMT过程可能发生的机制。 结果：1、通过倒置相差显微镜下观察，发现A549细胞在浓度为10ng/ml的TGF-β1作用48h的条件下，A549细胞形态发生了改变，由原本的鹅卵石状上皮样细胞形态转变为梭形形态，而且细胞之间的间隙变的较大，细胞之间的连接也随之变的松散。2、在我们研究的63种中药提取物中，我们发现，在知母、防己、何首乌、藤梨根、虎杖、甘草这6种中药提取物的作用下，TGF-β1介导的A549细胞发生的EMT过程似乎被抑制或是被逆转了。A549细胞分别在这6种醇提物最佳剂量作用下，形态上都维持了原有的上皮样特征;在蛋白水平上，A549细胞在这6种醇提物的影响下，上皮标志蛋白E-cadhein由原来的EMT模型中的下降趋势转变为上升趋势，而间质标志蛋白vimentin则由原来EMT模型中的上升趋势转变为下降趋势。所以我们推断，这6中中药提取物中可能存在着能够抑制或逆转TGF-β1诱导的A549细胞发生的EMT过程。3、对上一步筛选的6种醇提物及文献中报道的5种可能影响EMT过程的单味中药提取物（总共11种）的醇提物进行研究，探讨其影响EMT过程的作用机制，发现防己、何首乌可能参与TGF-β/smad信号传导途径。而对何首乌和防己中的主要有效成分进行研究，找到了能够抑制TGF-β1介导的A549细胞发生的EMT过程的一个活性成分，即二苯乙烯苷。 结论：二苯乙烯苷能够抑制或者逆转TGF-β1诱导的A549细胞发生的EMT过程。在本项实验研究中，发现，二苯乙烯苷可以维持TGF-β1诱导的A549细胞的上皮样的细胞形态特征，抑制或是逆转其转化为间质样细胞形态特征。在分子蛋白水平上，上皮分子标志蛋白E-cadhein的下调趋势和间质分子标志蛋白vimentin的上调趋势在处理时间为48h、剂量为100ug/ml时较为明显。体现了何首乌苷抑制或者逆转EMT过程的时间及剂量依赖性。