乌头属植物是毛茛科多年生或一年生草本植物,在全世界范围内大约有400种,我国有200余种,中药如川乌、附子、草乌等均为本属植物。该属植物富含二萜生物碱,在镇痛抗炎、抗肿瘤、抗心律不齐等方面具有显著作用。由于二萜生物碱类成分大多具有毒性,从而大大限制了其临床使用。因此,解析此类成分在植物体内生物合成途径将从源头上理清乌头类药材毒性形成的分子机理,并为后续利用分子标记辅助育种及基因工程等技术选育低毒或者无毒品种,为乌头类药材的安全及可持续利用提供重要基础。课题组前期对乌头Aconitum carmichaeli中的萜类合酶基因家族进行了系统的功能鉴定,为了全面了解乌头属植物中萜类合酶基因的功能,本研究对另外3种乌头属植物显柱乌头A.stylosum、铁棒锤A.pendulum和露蕊乌头A.gymnandrum中萜类生物合成相关基因进行了系统的比较研究,并对二萜合酶基因家族进行了功能鉴定。首先采用Pacbio三代全长转录组（Iso-Seq）及转录组测序（RNA-Seq）相结合的方法,构建了上述3种植物的转录组文库。通过生物信息学分析深入挖掘了这3种植物中参与萜类骨架生物合成的上游基因和萜类合酶基因,并与乌头的相关基因家族进行比较分析,明确了在不同植物中收缩和扩张的基因家族。随后重点克隆了 16个二萜合酶基因（diTPSs）进行功能鉴定,明确了15个酶具有二萜合酶的功能,包括柯巴基焦磷酸合酶（copalyl-diphosphate synthase,CPS）和类贝壳杉烯合酶（kaurene synthase-like,KSL）。其中AsCPS3和AgCPS5为首次在乌头属植物中克隆得到的对映-8,13-柯巴基焦磷酸合酶（ent-8,13-CPP）基因;对三个物种来源KSL合酶的功能表征进一步明确其催化产物ent-kaurene和ent-atiserene是乌头属二萜生物碱前体的推测。本研究为乌头属植物二萜合酶的功能分化和二萜生物碱的生物合成途径解析奠定坚实基础。主要结论如下:1.3种植物转录组分析及萜类骨架生物合成相关基因的鉴定为充分获取全长转录本和基因的表达信息,分别对显柱乌头、露蕊乌头和铁棒锤进行了 Iso-seq和RNA-seq联合分析。显柱乌头为种子发芽后种植于人工气候室生长一个月的植株,露蕊乌头为种子消毒后在MS固体培养基上生长一个月的组培苗。分别提取显柱乌头和露蕊乌头地上部分（茎和叶）和根的总RNA,等量混合后用于Iso-seq测序,同时对地上部分和根进行RNA-seq分析。由于前期已经对野外采集的铁棒锤根、叶、花三个部位进行转录组测序,发现ent-CPP合酶主要在根中表达,并且检测到了乌头碱和二羟基乌头碱为主要成分,因此本次我们只对人工气候室生长1个月的铁棒锤根进行了三代全长测序分析。显柱乌头、铁棒锤和露蕊乌头分别得到31.66 Gb、20.53 Gb和91.50 Gb原始数据,经过CCS提取,FLNCs构建,以及二代数据校正,水平聚类分析及去冗余序列,最终分别得到20556、15400和111975个unigenes的全长转录组,平均长度为 2342 bp、1938 bp、1511 bp,N50 分别为 2612 bp、2092 bp、1575 bp。利用基因注释及同源序列比对等方法挖掘3种植物中参与萜类合成相关酶基因。结果显示:显柱乌头、铁棒锤、露蕊乌头转录组中分别鉴出30个、39个、39个候选基因参与萜类生物合成。与已公布的乌头转录组数据相比,我们发现乌头中参与萜类合成基因数量最多49个,其它依次为露蕊乌头、铁棒锤、显柱乌头。以乌头中萜类合成基因家族为参考,在已鉴定的20个基因家族中,3个基因家族在四个物种中非常保守,基因数量一致,8个基因家族在另外三个乌头属植物中均发生了一定程度的收缩,如乌头中二萜合酶基因为9个,露蕊乌头、铁棒锤、显柱乌头中分别为7个、7个、4个,而其它11个基因家族在四个物种中则发生不同程度的收缩与扩张。这些基因在乌头属不同植物中的分布情况,为后续研究特定物种中特殊化合物的生物合成奠定基础。进一步预测上述基因功能,我们利用RNA-seq数据对乌头属四种植物萜类合成相关基因表达谱进行系统分析。结果发现上述四种植物中二萜生物合成途径占优势地位,这和其体内含有丰富的二萜生物碱类成分有关。显柱乌头中MEP 途径（Methylerythritol phosphate pathway,MEP pathway）与候选二萜合酶基因AsCPS2、AsCPS3、AsKSL1、AsKSL2主要在地上部位有优势表达,露蕊乌头中MEP途径和候选二萜合酶基因AgCPS1、AgCPS2、AgCPS3、AgCPS5、AgKSL1主要在地上部位中有优势表达,铁棒锤中MEP途径基因主要在叶中有优势表达。乌头中MEP途径和二萜合酶基因在地上和根中均有优势表达,据报道乌头中9个二萜合酶基因均有活性。因此,上述三种植物中地上部分或根中有高水平表达的候选二萜合酶基因极有可能参与到各物种二萜生物碱的生物合成过程。2.二萜合酶基因的克隆及生物信息学分析对上述全长转录组分析得到的16个候选二萜合酶基因进行克隆,结果除AsKSL2、ApCPS1-2、AgCPS5外,成功克隆到13个二萜合酶基因。其中对转录本transcriptHQzcwtranscript13343/f3p0/2492 进行克隆时,得到 2 个转录本,分别命名为AsCPS1-1、AsCPS1-2。对转录本transcriptHQzcwtranscript12480/f2p0/257 进行克隆时,得到 3 个转录本,分别命名为AsKSL1-1、AsKSL1-3、AsKSL1-4。综上所述,我们共克隆到16个二萜合酶基因,其中显柱乌头7个,分别命名为AsCPS1-1,AsCPS1-2,AsCPS2,AsCPS3,AsKSL1-1,AsKSL1-3,AsKSL1-4;铁棒锤3个,分别命名为ApCPS1,ApCPS2,ApKSL1;露蕊乌头6个,命名为 AgCPS1,AgCPS2,AgCPS3,AgCPS4,AgCPS5,AgKSL1。对16个二萜合酶基因进行生物信息学分析,发现它们长度在2340-2409 bp之间,编码氨基酸长度在789-802之间。ExPASy在线分析显示其分子质量在89.4-91.97 kDa之间,候选基因的理论等电点为5.3-5.99。跨膜结构域分析显示18个基因均不含跨膜结构域。根据保守序列得知,AsCPS1-1、AsCPS1-2、AsCPS2、AsCPS3,ApCPS1、ApCPS2、AgCPS1、AgCPS2、AgCPS3、AgCPS4、AgCPS5均含有DXDD结构域,为Class Ⅱ型二萜合酶。AsKSL1-1、AsKSL1-3、AsKSL1-4、ApKSL1、AgKSL1 均含有 DDXXD,为 Class Ⅰ型二萜合酶。将上述16个含有正确结构域的二萜合酶与已鉴定的77个二萜合酶构建系统进化树,进一步预测它们可能的生化功能。结果显示AsCPS3和AgCPS5形成介于单子叶与双子叶植物Class Ⅱ型二萜合酶之间单独的分支,这提示它们是功能相对原始的二萜合酶。其余CPPs合酶与已鉴定的乌头CPPs合酶聚为单独的一类,与双子叶植物中主要参与赤霉素生物合成的CPS形成姊妹群,提示它们也可能催化二萜前体牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（geranylgeranyl diphosphate,GGPP）生成对映型柯巴基焦磷酸（ent-CPP）。三种植物中的KSLs合酶也与乌头中KSLs聚为单独一类,提示也将参与以ent-CPP为底物的二萜生物合成途径。同时,我们发现乌头属植物中二萜合酶基因不同于唇形科中二萜合酶基因,均形成了单独的分支,这说明该属植物中二萜合酶的功能分化多发生在该属植物内,可能与近期基因组复制及乌头多倍体化有关。3.通过原核表达和大肠杆菌代谢工程系统对16个二萜合酶进行功能鉴定利用同源重组的方法,将16个二萜合酶基因构建到原核表达载体pET32a中,通过热激法转化至大肠杆菌Transetta（DE3）,利用终浓度为0.4mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达。超声破碎后分别提取上述二萜合酶的总蛋白,利用His Trap HP纯化柱进行蛋白纯化,使用纯化蛋白进行体外酶促反应,GC-MS鉴定酶促产物,最终鉴定蛋白的生化功能。利用二萜前体GGPP和获取的11个Ⅱ型二萜合酶纯化蛋白进行体外酶促反应,通过碱性水解酶CIAP将CPP进行去磷酸化,使其能够被GC-MS捕获。利用二萜前体GGPP和获取的11个Ⅱ型二萜合酶纯化蛋白进行体外酶促反应,通过碱性水解酶CIAP将CPP进行去磷酸化,使其能够被GC-MS捕获。结果显示除AgCPS3没有活性外,其余10个CPSs均有活性。8个CPS,AsCPS1-1、AsCPS1-2、AsCPS2、ApCPS1、ApCPS2、AgCPS1、AgCPS2、AgCPS4 均 在16.7分钟产生一个单一峰1,保留时间和质谱均与小麦中ZmCPS2脱磷后的产物一致。而AsCPS3和AgCPS5在12.01min产生一个单一峰2,该峰与柳枝稷（Panicum virgatum）中PvCPS3脱磷后产物8,13-CPP的保留时间和质谱一致。由于系统进化树将上述8个CPSs预测为ent-CPP合酶,因此将其与拟南芥中AtKS合酶（特异与ent-CPP反应）共催化来确定其产物构型。结果显示8个全长CPSs分别与AtKS反应产生一个物质峰3（图4.6）,该峰与ZmCPS2和AtKS共催化产物ent-kaurene的保留时间和质谱一致,表明它们的产物均为ent-CPP型。同时我们发现AsCPS3和AgCPS5也可以和与AtKS反应产生ent-kaurene,因此初步预测8,13-CPP为ent构型。由于乌头及上述三种植物的CPS产物主要为ent-CPP,因此将克隆得到的5个KSL合酶分别与原核表达可溶性好的ZmCPS2共表达进行体外功能的鉴定。根据Reuben J.Peters课题组报道的二萜合酶大肠杆菌模块化代谢系统,在大肠杆菌体内完成两步二萜合酶反应,进而验证KSL功能。利用上述两个体系对KSL进行验证,结果在两个系统中均表明AsKSL1-3均可以催化ent-CPP生成ent-kaurene,ApKSL1 和 AgKSL1 可以催化 ent-CPP 生成 ent-atiserene。而AsKSL1-1、AsKSL1-4只在大肠杆菌代谢工程系统中检测到产物ent-kaurene。上述结果提示我们应该尝试不同的体系如烟草、酵母、大肠杆菌等系统进行功能验证。由于唇形科KSL合酶具有广泛的底物杂泛性,因此继续利用大肠杆菌代谢工程系统对上述活性好的ApKSL1和AgKSL1分别与产生11种不同CPP类型的Ⅱ型二萜合酶共表达,以观察乌头属植物中KSL合酶底物杂泛性情况。结果表明这两个KSL除了可以和ent-CPP反应外、均可以与产生8β-hydroxy-ent-CPP和ent-kolavenyl diphosphate 的Ⅱ型二萜合酶共表达,两个 KSLs 与8β-hydroxy-ent-CPP 反应结果一致,均产生了 ent-atiserene 和 manoyl oxide;与 ent-kolavenyl diphosphate反应时均产生了 ent-atiserene,不同的是只有ApKSL1产生了 manoyl oxide。基于上述结果,进一步对乌头中AcKSL2-1（ent-atiserene合酶）分别和产生 8β-hydroxy-ent-CPP 和 ent-kolavenyl diphosphate 的Ⅱ型二萜合酶共表达。我们发现乌头中 AcKSL2-1 和 8β-hydroxy-ent-CPP反应时,和 ApKSL1、AgKSL1一样,产生ent-atiserene 和 manoyl oxide;AcKSL2-1 与 ent-kolavenyl diphosphate进行反应时,和AgKSL1一样,只产生了ent-atiserene,没有产生manoyloxide。由此可见,虽然乌头属植物的KSL合酶也具有底物杂泛性,但其与不同底物反应的主产物只有ent-atiserene和manoyl oxide,这与唇形科KSL合酶的产物谱完全不同,具体机理有待进一步深入研究。本研究对显柱乌头、铁棒锤、露蕊乌头进行了全长转录组测序,并与乌头中萜类化合物骨架合成的相关基因进行了比较研究,对16个二萜合酶基因进行了功能鉴定并对乌头属KSL基因的底物杂泛性进行了初步探索,这些结果为研究乌头属二萜合酶基因的功能分化及后续开展二萜生物碱（DAs）生物合成途径的解析提供了重要的基础数据和参考。