论文部分内容阅读
目的：通过收集高血压肾损害患者的四诊资料及处方用药，综合分析纳入患者的中医证候要素分布规律及其与相关实验室指标的关系，明确导师治疗高血压肾损害的用药规律及核心药对，为高血压肾损害的规范化诊疗提供客观数据。在上述研究基础上，以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预大鼠肾动脉内皮细胞(RRAECs)构建血管内皮损伤模型，通过高通量miRNA-mRNA联合测序技术，从miRNA角度及转录后水平研究AngⅡ诱导血管内皮细胞功能障碍的分子机制。筛选确定补气活血中药黄芪-丹参药对代表性活性成分毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA的最佳配伍比例，探讨其改善AngⅡ诱导的内皮细胞功能障碍的作用靶点和调节机制，为阐明黄芪-丹参药对改善血管内皮功能、防治高血压肾损害的药理机制提供理论依据和实验支撑。
方法：
1.高血压肾损害患者的中医证候要素分布特点及导师用药规律研究：收集120例高血压肾损害患者的临床资料，使用SPSS软件对患者基本资料、证候要素分布进行统计分析，阐明高血压肾损害患者的中医证素分布规律，并系统分析各证素与患者年龄、高血压病史及血清胱抑素C(Cystatin C)、尿微量白蛋白(mALB)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)及估算肾小球滤过率(eGFR)等实验室指标的关系，探讨高血压肾损害的中医证素特征和基本病机。同时，统计导师临证处方，借助中医传承辅助平台软件，分析用药频次、药物之间的关联规则和组方规律，探索导师治疗高血压肾损害的用药经验，并筛选出核心药对，进行下一步的实验研究。
2.AngⅡ诱导的肾动脉内皮细胞损伤中miRNA差异表达谱的构建与生物信息学分析：以AngⅡ体外诱导RRAECs24h建立血管内皮损伤模型。基于高通量miRNA-mRNA联合测序，筛选在AngⅡ诱导的内皮细胞功能障碍中发挥关键作用的差异表达(DE)miRNA，分析AngⅡ对内皮细胞miRNA表达谱的影响，并寻找其下游靶基因，通过生物信息学方法分析，构建DEmiRNA与其靶基因的局部网络图，探讨miRNA在AngⅡ诱导的血管内皮功能障碍中的调控机制，筛选出关键miRNA进行下一步研究。
3.miRNA-200c-3p靶向ZEB2参与AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的机制研究：采用生物信息学方法进行分子对接，预测ZEB2是否是miRNA-200c-3p的靶基因。构建ZEB2-3UTR质粒，在HEK293T细胞内进行转染，应用双荧光素酶报告基因系统检测miRNA-200c-3p对ZEB2的靶向作用。荧光定量PCR(qPCR )评估细胞内转染效率后，采用MTT法和transwell实验分别检测miRNA-200c-3p对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的影响。应用qPCR和WesternBlot技术分别检测两组细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达，并观察ZEB2对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移功能的影响。同样，应用上述方法检测miRNA-200c-3p对AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2mRNA和蛋白表达的影响，进一步明确miRNA-200c-3p对ZEB2的靶向调控作用。
4.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导RRAECs的保护作用研究：采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.5 mg/L、1.5 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、50 mg/L)和丹参酮ⅡA(1 mg/L、3 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、100 mg/L)改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的最佳药物浓度，继而将毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA按比例进行配伍，确定药对活性成分的最佳配伍比例。在此基础上，探讨毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的保护作用，观察其对细胞凋亡、细胞迁移、活性氧生成、线粒体自噬及线粒体膜电位的影响。
5.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍通过miRNA-200c-3p靶向ZEB2对AngⅡ诱导RRAECs的保护机制研究：采用miRNA-mRNA联合测序技术，运用生物信息学分析方法，构建毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍组与模型组中miRNA的差异表达谱，筛选毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的作用靶点。分别采用MTT法和transwell实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的影响。qPCR技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导的RRAECs中miRNA-200c-3p和ZEB2mRNA表达的影响；WesternBlot方法检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2蛋白表达的影响。
结果：
1.通过对120例高血压肾损害患者的一般资料进行分析发现，男性患者66例，女性患者54例，男女比例为1.22∶1，男性患者比例高于女性。纳入患者的平均年龄为64.40±10.39岁，其中，最大年龄为89岁，最小年龄为47岁。60岁以上的老年人为高血压肾损害的主要发病人群，占比70.83%。所有纳入患者的高血压平均病史为12.2±8.65年，其中，最短病史为5年，最长病史为40年。合并症方面，高血压肾损害合并冠心病的患者数量最多，为38例；其次为合并血脂异常的患者，共36例。纳入患者中，使用最多的降压药物为钙离子通道阻滞剂(CCB)，其次为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)。两类药物联用方案中，采用ARB+CCB治疗的患者例数最多；其次为β受体阻滞剂+CCB组合；三药联用方案中，采用ARB+CCB+β受体阻滞剂治疗的患者例数最多；其次为ARB+CCB+利尿剂组合。纳入患者的虚性证候要素主要由气虚、阴虚和阳虚构成，其中，气虚证素的患者例数最多，共100例，占比83.33%。实性证候要素主要由血瘀、湿热、肝火(阳)和痰浊构成，其中，血瘀证素的患者例数最多，共67例，占比55.83%。在所有纳入的高血压肾损害患者中，单一证素患者最少，共4例，肝火(阳)患者3例，湿热患者1例，占总例数的3.33%。双证素患者最多，共63例，占总例数的52.5%，其中，气虚+血瘀患者例数最多，共28例，占比44.44%。三证素患者共53例，占总例数的44.27%，其中，气虚+血瘀+湿热患者例数最多，共20例，占比37.74%。各证素患者的平均年龄、尿β2-MG及eGFR在组间的比较有统计学差异，而在高血压病史、血清CystatinC及尿mALB方面，各证素的组间差异无统计学意义。气虚证素患者的尿β2-MG均值最高，其次为血瘀。血瘀证素患者的平均年龄明显高于其他证素患者，而eGFR水平则显著低于其他证素患者。血瘀、气虚证素患者的血清CystatinC、尿mALB水平均高于其他证素患者。用药规律方面，丹参、黄芪分别是导师治疗高血压肾损害应用频率最高的活血、补气中药，黄芪-丹参是应用频率最高的药对组合。治疗高血压肾损害的核心药物包括丹参、黄芪、当归、川芎、黄连、大黄。
2.以5x10-7mol/LAngⅡ诱导RRAECs24h建立血管内皮损伤模型。经miRNA-mRNA联合测序检测，AngⅡ诱导后共筛选出443个DEmRNA，其中66个上调，377个下调(foldchange>1.5or＜0.67，P＜0.05)；共检测到58个DEmiRNA，其中，55个上调，3个下调(foldchange>1.5or＜0.67，P＜0.05)。与对照组相比，属于miRNA-200家族不同成熟体的miRNA-200a-3p、miRNA-200b-3p、miRNA-200c-3p、miRNA-429在AngⅡ组中均差异高表达，提示miRNA-200家族在AngⅡ诱导的RRAECs损伤中具有重要作用，故后续实验选用家族中最显著高表达的miRNA-200c-3p作为重点研究对象。此外，DEmiRNA靶基因富集的GO条目与DEmRNA的富集结果相类似，均涉及细胞迁移、细胞增殖及小分子结合等方面；KEGGPathway分析显示AngⅡ可能调控的靶基因与mTOR、AMPK、自噬等信号通路密切相关。
3.生物信息学软件预测miRNA-200c-3p与ZEB23UTR序列之间存在结合位点，双荧光素酶报告基因检测结果显示，miRNA-200c-3p能够负调控ZEB2的表达。与对照组比较，AngⅡ诱导的RRAECs中，miRNA-200c-3p的表达显著升高(P＜0.001)，ZEB2的mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.001)表达明显降低。敲减miRNA-200c-3p可上调AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2mRNA(P＜0.001)和蛋白(P＜0.01)的表达，显著减弱AngⅡ对细胞增殖(24h、48h、72h、96h四个时间点的比较，分别为P>0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)和迁移(P＜0.001)能力的抑制作用；反之，过表达miRNA-200c-3p，则下调AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.001)的表达，且明显增强AngⅡ对RRAECs增殖(24h、48h、72h、96h四个时间点的比较，分别为P>0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)和迁移(P＜0.05)能力的抑制功效。上调ZEB2表达至少可部分逆转miRNA-200c-3p对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的抑制作用。
4.AngⅡ诱导RRAECs功能障碍，可使RRAECs凋亡率升高，细胞迁移能力下降，活性氧生成增多，线粒体自噬激活，线粒体膜电位降低。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可在一定程度上改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍，降低细胞凋亡率，促进细胞迁移，减少活性氧生成，抑制线粒体自噬，升高线粒体膜电位。
5.测序结果显示，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导RRAECs功能障碍的保护机制可能与miRNA调控细胞凋亡、炎症等相关基因及细胞因子有关。与模型组比较，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍组miRNA-200c-3p的表达水平显著下调(P＜0.001)，ZEB2的mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.01)表达均有上调；同时，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预可显著减弱AngⅡ对RRAECs增殖(在24h、48h、72h、96h四个时间点的比较，分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)和迁移能力(P＜0.01)的抑制作用。
结论：1.临床研究：高血压肾损害患者各证候要素分布由多至少依次为气虚、血瘀、湿热、肝火(阳)、阴虚、痰浊、阳虚。气虚+血瘀为高血压肾损害患者中占比最高的证素组合。各证素患者在年龄、尿β2-MG、eGFR方面的组间比较有统计学差异。本病病机总属本虚标实、虚实夹杂，气虚血瘀为其基本病机。导师治疗高血压肾损害以补气活血为主，兼以清热化湿、通腑排毒；黄芪-丹参为其应用频率最高的药对组合。2.实验研究：(1)AngⅡ通过升高miRNA-200c-3p水平下调靶基因ZEB2的表达，抑制RRAECs的增殖和迁移能力，使血管内皮功能受损。(2)毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可在一定程度上改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍，降低细胞凋亡率，促进细胞迁移，减少活性氧生成，抑制线粒体自噬，升高线粒体膜电位。(3)毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍显著增强AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的机制可能与其下调miRNA-200c-3p从而靶向上调ZEB2表达密切相关。
方法：
1.高血压肾损害患者的中医证候要素分布特点及导师用药规律研究：收集120例高血压肾损害患者的临床资料，使用SPSS软件对患者基本资料、证候要素分布进行统计分析，阐明高血压肾损害患者的中医证素分布规律，并系统分析各证素与患者年龄、高血压病史及血清胱抑素C(Cystatin C)、尿微量白蛋白(mALB)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)及估算肾小球滤过率(eGFR)等实验室指标的关系，探讨高血压肾损害的中医证素特征和基本病机。同时，统计导师临证处方，借助中医传承辅助平台软件，分析用药频次、药物之间的关联规则和组方规律，探索导师治疗高血压肾损害的用药经验，并筛选出核心药对，进行下一步的实验研究。
2.AngⅡ诱导的肾动脉内皮细胞损伤中miRNA差异表达谱的构建与生物信息学分析：以AngⅡ体外诱导RRAECs24h建立血管内皮损伤模型。基于高通量miRNA-mRNA联合测序，筛选在AngⅡ诱导的内皮细胞功能障碍中发挥关键作用的差异表达(DE)miRNA，分析AngⅡ对内皮细胞miRNA表达谱的影响，并寻找其下游靶基因，通过生物信息学方法分析，构建DEmiRNA与其靶基因的局部网络图，探讨miRNA在AngⅡ诱导的血管内皮功能障碍中的调控机制，筛选出关键miRNA进行下一步研究。
3.miRNA-200c-3p靶向ZEB2参与AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的机制研究：采用生物信息学方法进行分子对接，预测ZEB2是否是miRNA-200c-3p的靶基因。构建ZEB2-3UTR质粒，在HEK293T细胞内进行转染，应用双荧光素酶报告基因系统检测miRNA-200c-3p对ZEB2的靶向作用。荧光定量PCR(qPCR )评估细胞内转染效率后，采用MTT法和transwell实验分别检测miRNA-200c-3p对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的影响。应用qPCR和WesternBlot技术分别检测两组细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达，并观察ZEB2对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移功能的影响。同样，应用上述方法检测miRNA-200c-3p对AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2mRNA和蛋白表达的影响，进一步明确miRNA-200c-3p对ZEB2的靶向调控作用。
4.毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导RRAECs的保护作用研究：采用MTT法筛选毛蕊异黄酮(0.5 mg/L、1.5 mg/L、5 mg/L、15 mg/L、50 mg/L)和丹参酮ⅡA(1 mg/L、3 mg/L、10 mg/L、30 mg/L、100 mg/L)改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的最佳药物浓度，继而将毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA按比例进行配伍，确定药对活性成分的最佳配伍比例。在此基础上，探讨毛蕊异黄酮、丹参酮ⅡA及其配伍对AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的保护作用，观察其对细胞凋亡、细胞迁移、活性氧生成、线粒体自噬及线粒体膜电位的影响。
5.毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍通过miRNA-200c-3p靶向ZEB2对AngⅡ诱导RRAECs的保护机制研究：采用miRNA-mRNA联合测序技术，运用生物信息学分析方法，构建毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍组与模型组中miRNA的差异表达谱，筛选毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍的作用靶点。分别采用MTT法和transwell实验观察毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的影响。qPCR技术检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导的RRAECs中miRNA-200c-3p和ZEB2mRNA表达的影响；WesternBlot方法检测毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2蛋白表达的影响。
结果：
1.通过对120例高血压肾损害患者的一般资料进行分析发现，男性患者66例，女性患者54例，男女比例为1.22∶1，男性患者比例高于女性。纳入患者的平均年龄为64.40±10.39岁，其中，最大年龄为89岁，最小年龄为47岁。60岁以上的老年人为高血压肾损害的主要发病人群，占比70.83%。所有纳入患者的高血压平均病史为12.2±8.65年，其中，最短病史为5年，最长病史为40年。合并症方面，高血压肾损害合并冠心病的患者数量最多，为38例；其次为合并血脂异常的患者，共36例。纳入患者中，使用最多的降压药物为钙离子通道阻滞剂(CCB)，其次为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)。两类药物联用方案中，采用ARB+CCB治疗的患者例数最多；其次为β受体阻滞剂+CCB组合；三药联用方案中，采用ARB+CCB+β受体阻滞剂治疗的患者例数最多；其次为ARB+CCB+利尿剂组合。纳入患者的虚性证候要素主要由气虚、阴虚和阳虚构成，其中，气虚证素的患者例数最多，共100例，占比83.33%。实性证候要素主要由血瘀、湿热、肝火(阳)和痰浊构成，其中，血瘀证素的患者例数最多，共67例，占比55.83%。在所有纳入的高血压肾损害患者中，单一证素患者最少，共4例，肝火(阳)患者3例，湿热患者1例，占总例数的3.33%。双证素患者最多，共63例，占总例数的52.5%，其中，气虚+血瘀患者例数最多，共28例，占比44.44%。三证素患者共53例，占总例数的44.27%，其中，气虚+血瘀+湿热患者例数最多，共20例，占比37.74%。各证素患者的平均年龄、尿β2-MG及eGFR在组间的比较有统计学差异，而在高血压病史、血清CystatinC及尿mALB方面，各证素的组间差异无统计学意义。气虚证素患者的尿β2-MG均值最高，其次为血瘀。血瘀证素患者的平均年龄明显高于其他证素患者，而eGFR水平则显著低于其他证素患者。血瘀、气虚证素患者的血清CystatinC、尿mALB水平均高于其他证素患者。用药规律方面，丹参、黄芪分别是导师治疗高血压肾损害应用频率最高的活血、补气中药，黄芪-丹参是应用频率最高的药对组合。治疗高血压肾损害的核心药物包括丹参、黄芪、当归、川芎、黄连、大黄。
2.以5x10-7mol/LAngⅡ诱导RRAECs24h建立血管内皮损伤模型。经miRNA-mRNA联合测序检测，AngⅡ诱导后共筛选出443个DEmRNA，其中66个上调，377个下调(foldchange>1.5or＜0.67，P＜0.05)；共检测到58个DEmiRNA，其中，55个上调，3个下调(foldchange>1.5or＜0.67，P＜0.05)。与对照组相比，属于miRNA-200家族不同成熟体的miRNA-200a-3p、miRNA-200b-3p、miRNA-200c-3p、miRNA-429在AngⅡ组中均差异高表达，提示miRNA-200家族在AngⅡ诱导的RRAECs损伤中具有重要作用，故后续实验选用家族中最显著高表达的miRNA-200c-3p作为重点研究对象。此外，DEmiRNA靶基因富集的GO条目与DEmRNA的富集结果相类似，均涉及细胞迁移、细胞增殖及小分子结合等方面；KEGGPathway分析显示AngⅡ可能调控的靶基因与mTOR、AMPK、自噬等信号通路密切相关。
3.生物信息学软件预测miRNA-200c-3p与ZEB23UTR序列之间存在结合位点，双荧光素酶报告基因检测结果显示，miRNA-200c-3p能够负调控ZEB2的表达。与对照组比较，AngⅡ诱导的RRAECs中，miRNA-200c-3p的表达显著升高(P＜0.001)，ZEB2的mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.001)表达明显降低。敲减miRNA-200c-3p可上调AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2mRNA(P＜0.001)和蛋白(P＜0.01)的表达，显著减弱AngⅡ对细胞增殖(24h、48h、72h、96h四个时间点的比较，分别为P>0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)和迁移(P＜0.001)能力的抑制作用；反之，过表达miRNA-200c-3p，则下调AngⅡ诱导的RRAECs中ZEB2mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.001)的表达，且明显增强AngⅡ对RRAECs增殖(24h、48h、72h、96h四个时间点的比较，分别为P>0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)和迁移(P＜0.05)能力的抑制功效。上调ZEB2表达至少可部分逆转miRNA-200c-3p对AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的抑制作用。
4.AngⅡ诱导RRAECs功能障碍，可使RRAECs凋亡率升高，细胞迁移能力下降，活性氧生成增多，线粒体自噬激活，线粒体膜电位降低。毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可在一定程度上改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍，降低细胞凋亡率，促进细胞迁移，减少活性氧生成，抑制线粒体自噬，升高线粒体膜电位。
5.测序结果显示，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍对AngⅡ诱导RRAECs功能障碍的保护机制可能与miRNA调控细胞凋亡、炎症等相关基因及细胞因子有关。与模型组比较，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍组miRNA-200c-3p的表达水平显著下调(P＜0.001)，ZEB2的mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.01)表达均有上调；同时，毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍干预可显著减弱AngⅡ对RRAECs增殖(在24h、48h、72h、96h四个时间点的比较，分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)和迁移能力(P＜0.01)的抑制作用。
结论：1.临床研究：高血压肾损害患者各证候要素分布由多至少依次为气虚、血瘀、湿热、肝火(阳)、阴虚、痰浊、阳虚。气虚+血瘀为高血压肾损害患者中占比最高的证素组合。各证素患者在年龄、尿β2-MG、eGFR方面的组间比较有统计学差异。本病病机总属本虚标实、虚实夹杂，气虚血瘀为其基本病机。导师治疗高血压肾损害以补气活血为主，兼以清热化湿、通腑排毒；黄芪-丹参为其应用频率最高的药对组合。2.实验研究：(1)AngⅡ通过升高miRNA-200c-3p水平下调靶基因ZEB2的表达，抑制RRAECs的增殖和迁移能力，使血管内皮功能受损。(2)毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍可在一定程度上改善AngⅡ诱导的RRAECs功能障碍，降低细胞凋亡率，促进细胞迁移，减少活性氧生成，抑制线粒体自噬，升高线粒体膜电位。(3)毛蕊异黄酮和丹参酮ⅡA配伍显著增强AngⅡ诱导的RRAECs增殖和迁移能力的机制可能与其下调miRNA-200c-3p从而靶向上调ZEB2表达密切相关。