【摘 要】
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甘薯是世界上仅次于马铃薯和木薯的第三大块根、块茎类作物,同时甘薯也是我国重要的粮食、饲料、工业原料及能源用作物。近年来,甘薯病毒病在湖南省发生日益加重,影响湖南甘薯产业的稳定健康发展。为掌握湖南省甘薯种质资源病毒病发生情况,本研究首先利用Small RNA深度测序技术对湖南甘薯种质资源进行检测分析,揭示甘薯DNA病毒种类;再通过PCR克隆鉴定甘薯曲叶病毒和甘薯杆状病毒基因全序列,并构建甘薯曲叶病毒
【基金项目】
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湖南省自然科学基金; 国家甘薯产业技术体系长沙综合试验站; 湖南省甘薯工程技术研究中心; 长沙市甘薯工程技术研究中心; 甘薯种质资源创制与应用创新团队;
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甘薯是世界上仅次于马铃薯和木薯的第三大块根、块茎类作物,同时甘薯也是我国重要的粮食、饲料、工业原料及能源用作物。近年来,甘薯病毒病在湖南省发生日益加重,影响湖南甘薯产业的稳定健康发展。为掌握湖南省甘薯种质资源病毒病发生情况,本研究首先利用Small RNA深度测序技术对湖南甘薯种质资源进行检测分析,揭示甘薯DNA病毒种类;再通过PCR克隆鉴定甘薯曲叶病毒和甘薯杆状病毒基因全序列,并构建甘薯曲叶病毒侵染性克隆,进行致病性分析;最后对湖南甘薯种质进行DNA病毒流行分析。取得如下结论:1.用Small RNA深度测序技术检测出7种RNA病毒和2种DNA病毒。通过Small RNA深度测序技术对甘薯样品进行测序,共检测出甘薯褪绿斑点病毒、甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯病毒2、甘薯C病毒、甘薯G病毒7种RNA病毒和Sweepoviruses、SPBV 2种DNA病毒。通过对2种DNA病毒contigs组装拼接,甘薯杆状病毒B和甘薯杆状病毒A分别占DNA病毒基因组全长的63.23%和30.4%;甘薯金脉病毒占该病毒基因组全长的24.40%;13个甘薯曲叶病毒株系占各自病毒基因组全长的14.39-36.83%。2.用PCR鉴定出2个甘薯杆状病毒基因全序列。从具有病毒感染症状(表现为扇形叶片、节间短小、畸形)的甘薯样本中鉴定出2个甘薯杆状病毒基因全序列:MK052980和MK052981。系统进化树分析表明2个病毒基因与SPBV-B(FJ560944)相似性分别为86%和94%,与SPBV(FJ560943)相似性分别为81%和83%。ORFs氨基酸序列分析表明MK052980序列ORF3a编码蛋白序列中第414、560位点的2个氨基酸缺失,同时增加了6个氨基酸,分别位于第459-461aa、509aa、540-541aa位点。3.用PCR鉴定出12个甘薯曲叶病毒基因全序列,进行致病性分析。从具有病毒感染症状(表现为叶片上卷、皱缩、褪绿斑点)的甘薯样本中鉴定出12个甘薯曲叶病毒基因全序列:MK052982-MK052988和MW021472-MW021476。系统进化树分析表明12个病毒基因可聚为4类,其中SPLCV(41-56)与来自湖南的分离物KJ013578、KJ013574亲缘关系相对较远。分离物SPLCV(6-1)和SPLCV(6-A5)的遗传距离最近,为0.001。聚为另一类的SPLCV(8-76)与来自山东的分离物MK931311遗传距离为0.007。重组分析表明,SPLCV(3-3)、SPLCV(5-1)、SPLCV(6-1)、SPLCV(6-A5)、SPLCV(8-47)、SPLCV(6-68)、SPLCV(194)、SPLCV(77)、和SPLCV(41-56)为重组株系,其中有7个SPLCV病毒基因重组位点集中在IR区和AV1、AV2区域,2个病毒基因重组位点在AC1和AC2区域,3个病毒基因重组位点出现在AC3、AC4区域。进一步构建了p BA002-myc-SPLCV-215侵染性克隆,侵染甘薯品种“湘菜薯3号”和三生烟,两种受体植株都产生皱缩、卷叶、褪绿等症状;用含SPLCV的甘薯植株叶片摩擦接种相同的受体植株,能产生皱缩和卷叶症状。4.用PCR进行湖南甘薯种质DNA病毒流行分析。180份甘薯种质资源中,有SPLCV阳性22份,占总数的12.2%;SPBV阳性32份,占总数的17.78%;同时有SPLCV和SPBV这两种病毒阳性8份,占总数的3.9%。不同种类的病毒在湖南各市出现情况有差异,其中检出SPLCV的市县有长沙、永州、怀化、邵阳、郴州、常德、娄底、益阳、岳阳和株洲。检出SPBV的市县有长沙、永州、怀化、衡阳和邵阳。检出两病毒复合侵染的市县有怀化、长沙、永州和邵阳,整体呈现出分布范围广、湘西南地区分布多,湘东北和湘西北分布较少的特点。本研究从甘薯植株检测出SPBV和Sweepoviruses两种DNA病毒,同时鉴定了在国内首次报道的SPBV-B基因全序列;鉴定了12个SPLCV基因全序列,9个为重组序列,重组位点在IR区、AV1、AV2和AC1-AC4区域,并构建p BA002-myc-SPLCV(21-5)侵染性克隆,侵染“湘菜薯3号”和三生烟产生皱缩、褪绿症状,表明SPLCV具有致病性;进一步对甘薯DNA病毒进行流行分析,发现在湖南流行特点为湘西南多、湘东北和湘西北少。本研究将为甘薯DNA病毒防控及甘薯产业健康发展提供有力理论支撑。
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