【摘 要】
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番茄红素环化酶是调控番茄红素代谢的关键酶,与类胡萝卜素的含量密切相关。因此,为培育高产番茄红素番茄提供目标基因和理论依据,本文针对番茄中4个番茄红素环化酶基因,通过CRISPR/CAS9基因编辑系统获得多个高番茄红素含量的基因编辑番茄,并采用分子生物学、遗传学以及组学等方法,分析了番茄红素环化酶参与调控番茄植物生长发育和果实着色的生物学作用及机制。取得的主要研究结果如下:1、建立了番茄中多靶点CR
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番茄红素环化酶是调控番茄红素代谢的关键酶,与类胡萝卜素的含量密切相关。因此,为培育高产番茄红素番茄提供目标基因和理论依据,本文针对番茄中4个番茄红素环化酶基因,通过CRISPR/CAS9基因编辑系统获得多个高番茄红素含量的基因编辑番茄,并采用分子生物学、遗传学以及组学等方法,分析了番茄红素环化酶参与调控番茄植物生长发育和果实着色的生物学作用及机制。取得的主要研究结果如下:1、建立了番茄中多靶点CRISPR/CAS9系统。序列比对确定番茄中含有4个番茄红素环化酶基因,分别为Sl Lcy B1、Sl Lcy B2、Sl Cyc B和Sl Lcy E。利用CRISPR-P等网站,筛选出每个基因20nt左右的最适靶序列。以Overlapping PCR往带有拟南芥U3/U6启动子的sg RNA表达盒中导入靶序列,采用Golden Gate cloning组装Cas9载体和多个g RNA表达盒片段,获得并鉴定了多敲番茄红素环化酶基因载体p SL-Pubi-H-4。通过农杆菌介导的遗传转化将p SL-Pubi-H-4载体转入野生型番茄M82中,获得200株有潮霉素抗性的转基因番茄苗,经扩增Sl Lcy B1、Sl Lcy B2、Sl Cyc B和Sl Lcy E片段并测序比对,获得3株有编辑效果的T0代番茄突变体。将这三株T0代突变体稳定自交遗传至T2代,结合off-target分析,筛选出不携带外源基因且发生了碱基改变的marker-free番茄突变体119-6（Sl Lcy B2敲除）、10-22（Sl Cyc B敲除）、10-1（Sl Lcy B2和Sl Cyc B敲除）、119-3（Sl Lcy B1敲除）、10-6（Sl Lcy B2和Sl Cyc B敲除,Sl Lcy B1双峰）和10-6-1（Sl Lcy B1,Sl Lcy B2和Sl Cyc B敲除）。2、与野生型M82植株相比,番茄突变体种子萌发率提高,播种后3-5天,其萌发率为119-3＞119-6＞10-1≈10-6＞10-22＞M82。番茄突变体均表现为明显矮化,播种后一个月的幼苗期番茄,119-3、119-6、10-1、10-6和10-22主茎高度约为野生型的50%-60%,其中10-6-1发育异常,叶片白化,主茎约为野生型的30%。此外,各突变体叶片中叶绿素相对降低,其中10-6-1中只能检测到极少量的叶绿素。番茄果实破色10天后的番茄果肉中番茄红素含量分析发现,番茄突变体的番茄红素含量均显著提高,其中119-3含量最高,约为野生型的3倍;119-6含量最低,但仍为野生型的1.5倍。3、119-3突变体（命名为LC）的果实在前熟期开始表现出明显的黄色,通过前熟期LC和M82番茄带皮果肉转录组测序,筛选得到了2655个差异基因,其中783个下调,1872个上调。KEGG注释最多的两个通路为代谢途径（47.52%）和次级代谢物的生物合成（25.57%）。KEGG富集分析的TOP3为次级代谢物的生物合成、植物病原菌互作和植物激素信号传导。运用液相色谱串联质谱的方法检测了果实的类胡萝卜素和ABA的含量,结果表明LC中叶黄素、β-胡萝卜素和紫黄质含量相对于M82明显减少,M82中检测不到的γ-胡萝卜素和番茄红素,但在LC中检测含量分别为3.067ug/g和61.133ug/g,LC中八氢番茄红素含量约为M82中的100倍。相对于野生型,LC中番茄红素及其上游类胡萝卜素含量的占比在总类胡萝卜素中明显增加。此外也发现LC中ABA及ABA-GE含量相对于M82显著降低,分别约为野生型的13%和36%。4、KEGG注释中类胡萝卜素生物合成和植物激素信号传导关联分析,发现类胡萝卜素生物合成途径中Solyc04g040190.1等5个基因表达量与LC前熟期果实中番茄红素、γ-胡萝卜素和八氢番茄红素的含量呈负相关,与紫黄质、新黄质、β-胡萝卜素、海胆烯酮、叶黄素、叶黄素肉豆蔻酸脂和β-隐黄质呈正相关;另外9个基因则与之相反。而在植物激素信号传导途径中,有80个差异基因也与类胡萝卜素含量的变化有相关性。本研究培育了多个高产番茄红素的基因编辑番茄材料,在转录组和代谢组层面解析了番茄中Sl Lcy B1、Sl Lcy B2和Sl Cyc B参与调控类胡萝卜素合成代谢和植物激素信号传导的功能,发现Sl Lcy B1是早期主要调控番茄果实颜色的基因之一,多种类胡萝卜素有作为植物激素信号传导的标记物的潜力,为后续高番茄红素和彩色番茄的育种提供理论指导和材料支撑。
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