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目的探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染中枢神经元细胞(neuron2a.N2a),细胞膜上的Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核仁素受体(Nucleolin,NCL或C23)的变化情况,研究TLR4和核仁素受体在RSV感染中枢神经系统所致损伤中的介导作用,为临床RSV感染中枢神经系统的预防和治疗提供新的思路。方法以RSV感染体外培养的N2a细胞,并通过siRNA沉默TLR4、核仁素受体表达,分别于感染后1、2、4、12、24和48 h不同时间点收集细胞和培养上清液。(1)激光共聚焦显微镜检测TLR4、核仁素受体与RSV F蛋白结合情况,以及神经核蛋白(NeuN)在N2a细胞中阳性细胞数目的表达变化；(2)用TRIzol法提取N2a细胞总RNA,通过实时荧光定量PCR法检沏TLR4、C23 mRNA 转录水平变化；(3)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点TLR3、TLR4、TLR7.C23以及NF-κB蛋白水平的表达变化；(4)流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；(5)空斑形成实验(plaque forming unit,PFU)检测各组细胞培养上清液中病毒增殖的滴度；(6)酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子的表达。结果(1)激光共聚焦显微镜检测结果显示,TLR4和C23受体在N2a细胞膜表面可以结合RSV F蛋白,在RSV感染1、2和4 h的入胞过程中,随着感染时间点的延长,F蛋白与TLR4和C23的结合逐渐增加；TLR4被干扰后,RSV F蛋白标记的蓝色荧光表达强度较RSV感染组和C23 siRNA组降低,表明TLR4与F蛋白结合减少,RSV在N2a细胞内增殖能力减弱；C23受体沉默后,核仁素受体与F蛋白结合减少,但可见TLR4结合更多F蛋白,提示TLR4可结合更多的RSV进入N2a细胞增殖；RSV感染组中N2a细胞中NeuN标记的阳性细胞数目较TLR4siRNA、C23 siRNA组的阳性细胞数目明显降低。(2)在mRNA转录水平,TLR4和C23在感染1-4 h的入胞过程表达量逐渐增高,4 h后表达量降低,说明TLR4和C23在细胞膜上识别RSV入胞过程中具有重要的作用；在瞬时转染TLR4 siRNA后,TLR4和C23蛋白的表达虽有上调,但表达量都比RSV感染组同时间点明显下降,且下降有统计学意义；在加入C23siRNA后,TLR4和C23 mRNA表达比RSV感染组同一时间点的表达量降低。(3) Western b lot法测定结果显示,正常对照组中TLR4和C23蛋白表达量较低,在RSV感染组,TLR4和C23蛋白在感染的1、2和4 h表达水平开始增强,4 h达到最高表达量,4 h后开始下降,至感染的48 h时,TLR4和C23蛋白表达水平较正常对照组一直处于增强状态；在TLR4或C23 siRNA组,TLR4和C23蛋白表达虽有上调,但表达量都比RSV感染组同时间点明显下降,且具有统计学意义。RSV感染组中TLR3/TLR7/NF-KB蛋白表达升高具有时间依赖性；在C23siRNA组,TLR3/TLR7/NF-KB蛋白的表达量虽有上调,仍比RSV感染组同时间点降低；在给予TLR4 siRNA处理后,TLR3/TLR7/NF-KB与RSV感染组和C23siRNA组同时间点相比降低的更明显,具有显著统计学意义；通过阻断TLR4或C23受体的表达,可以降低TLR3/TLR7/NF-KB在RSV感染N2a细胞过程中的活化过程。(4)流式细胞术结果显示,RSV感染N2a细胞48 h,可见细胞出现早期凋亡与晚期凋亡,晚期凋亡比例大于早期凋亡；TLR4 siRNA组和C23 siRNA组凋亡比例比RSV感染组凋亡比例下降,可见TLR4或C23阻断后,可以降低RSV感染N2a细胞的凋亡产生。(5)PFU结果显示,RSV感染N2a细胞培养上清中RSV滴度随感染时间的延长而逐渐增加；分别给予TLR4或C23 siRNA干扰后,RSV复制滴度水平较RSV感染组明显减少,TLR4 siRNA组较RSV感染组和C23 siRNA组病毒的滴度下降的更为明显,TLR4受体在识别RSV过程中可能具有更重要的作用。(6)ELSIA法结果显示,RSV感染组IL-6、IL-8和TNF-α炎症因子随着感染时间的延长逐渐升高；转染TLR4 siRNA后,IL-6、IL-8和TNF-a的含量与RSV感染组同时间点相比降低更明显；在C23 siR NA组,IL-6、IL-8和TNF-α的含量与RSV感染组相比下降；沉默TLR4或C23受体表达可以减轻RSV感染过程中所产生的炎症反应。结论N2a细胞膜表面的TLR4和核仁素受体可以结合RSV F蛋白,从而识别病毒进入细胞,活化TLR4、TLR3、TLR7、NF-κB的表达,使下游细胞炎性因子IL-6、IL-8和TNF-a分泌升高,介导天然免疫反应的产生,导致神经元的损伤与凋亡