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L-苹果酸是一种重要的四碳平台化合物,广泛应用于食品、医药、化工和航天等领域。微生物发酵法生产L-苹果酸具有底物来源广泛、产品成本低、产率及纯度高等优势,受到了越来越多的关注。目前L-苹果酸发酵菌株以曲霉为主,存在发酵周期长、过程调控困难及杂酸较多等问题,发酵法生产L-苹果酸仍未实现工业化。随着合成生物学的发展,利用代谢工程方法改造工业菌株生产L-苹果酸是解决发酵法生产L-苹果酸过程中现存问题的一种有效方法。本研究基于乳酸生产菌兼性厌氧、生长速率快、代谢途径简单及生物安全等优势,选用两种典型乳酸生产菌:凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）为底盘微生物。基于2 mol L-苹果酸/mol葡萄糖的最高理论转化率,围绕丙酮酸羧化固定CO2的关键技术,采用代谢工程和启动子工程联用的方法,设计并调控L-苹果酸合成途径,构建了高产L-苹果酸的工程菌株。本论文主要研究结果如下:（1）凝结芽孢杆菌启动子文库构建及在（2R,3R）-2,3-丁二醇合成中的应用。利用5’-RACE和启动子截短实验对凝结芽孢杆菌乳酸脱氢酶启动子（Pldh）进行表征,发现Pldh为串联型强启动子;以Pldh为模板进行饱和突变,构建了一个启动子文库,筛选出36个启动子用于后续基因的表达和调控。凝结芽孢杆菌AS1.2009敲除乳酸脱氢酶编码基因（ldh1/ldh2）后积累了（2R,3R）-2,3-丁二醇。通过基因发掘、序列比对分析及酶学性质表征,发现凝结芽孢杆菌中仅存在两种（2R,3R）-丁二醇脱氢酶（butanediol dehydrogenase,BDH）;其中BDH1属于中链脱氢酶超家族的乙醇脱氢酶家族,仅催化外消旋的乙偶姻生成2,3-丁二醇;BDH3属于短链脱氢酶超家族的（2R,3R）-BDH。为提高（2R,3R）-2,3-丁二醇产量,在敲除ldh基因的菌株M01中,整合表达来自B.coagulans 36D1的BDH-36D,并敲除丙酮酸竞争途径中乙醇脱氢酶基因（adhE）和丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）,摇瓶发酵获得4.94 g/L（2R,3R）-2,3-丁二醇。选择启动子文库中6个不同强度的启动子调控转录调控因子alsR的表达。与菌株BM03相比,由相对弱的启动子M2调控下的菌株BM03-M2生长速率提高,乙偶姻和丁二醇的产量分别增加了 14.6%和11.2%。菌株BM03-M2批式补料发酵84h,OD600达11.52;乙偶姻产量为18.75 g/L;（2R,3R）-2,3-丁二醇产量为30.3 g/L,产率达0.59 mol/mol葡萄糖。（2）基于启动子工程的凝结芽孢杆菌代谢途径改造合成L-苹果酸。在菌株M01中过表达谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶基因（pyc）和琥珀酸放线杆菌来源的苹果酸脱氢酶基因（mdh）,构建还原TCA（reductive TCA,rTCA）途径,菌株M02厌氧发酵积累1.23 g/L L-苹果酸。敲除甲酸合成的关键酶丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）和2,3-丁二醇合成途径中的α-乙酰乳酸合成酶基因（als）阻断丙酮酸支路代谢,菌株M03 L-苹果酸产量提高至1.5倍。利用启动子文库协同精细调控rTCA途径中两步反应,发现当两步反应均在强启动子调控下,菌株M03-M7的L-苹果酸产量最高,提高了 2.1倍。过表达自身来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）,强化草酰乙酸回补途径,菌株M03-M7-pck L-苹果酸产量提高了 3倍。通过两阶段批式补料发酵,菌株M03-M7-pck积累了 25.5g/L L-苹果酸,产率为0.3 g/g葡萄糖。（3）代谢工程改造乳酸乳球菌NZ9000合成L-苹果酸。在乳酸乳球菌NZ9000中过表达自身来源的丙酮酸羧化酶基因（pycAY715T）和琥珀酸放线杆菌来源的苹果酸脱氢酶基因（mdh）,同时敲除乳酸脱氢酶基因（ldh）,构建了 rTCA途径,获得重组菌株NZ02-1。厌氧发酵积累了 1.92 g/LL-苹果酸。敲除乳酸脱氢酶同工酶基因（ldhX/ldhB）、丙酮酸甲酸裂解酶基因（pfl）和α-乙酰乳酸合成酶基因（alsS）,菌株NZ03中L-苹果酸产量提高至1.63倍。以基因组中磷酸果糖激酶启动子Ppfk为模板,通过饱和突变构建了一个组成型启动子文库,筛选得到22个不同强度的启动子。选择组成型强启动子替换诱导型启动子,强化丙酮酸羧化酶的表达。发现在强启动子N20调控下,L-苹果酸产量提高了 2倍。菌株NZ20进行批式补料发酵,苹果酸产量达到14.1 g/L,转化率为0.19g/g葡萄糖。在发酵培养基中添加1.5 μg/mL血红素提高了微氧条件下乳酸乳球菌生物量,通过二阶段批式补料发酵,菌株NZ20的L-苹果酸终产量达20.52 g/L,转化率为0.29 g/g葡萄糖。综上所述,本论文选择兼性厌氧的乳酸产生细菌凝结芽孢杆菌和乳酸乳球菌为底盘微生物,采用代谢工程和启动子工程联合改造策略,成功构建了基于rTCA途径的L-苹果酸合成工程菌并提高了其产量。