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脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是卒中的严重类型之一,它发病率高、致残率高、死亡率高,临床上无明确真正获益的治疗手段。ICH后的脑损伤分为原发性损伤和继发性损伤两种,虽然有临床前研究报道环孢霉素A（Ciclosporin A,Cs A）对ICH后脑损伤有神经保护作用,但IC H后脑损伤的确切机制及Cs A发挥作用的确切机制仍不明确。本研究借助IV型胶原酶诱导的ICH小鼠模型,通过极微量RNA（Ribonucleic acid,核糖核酸）-seq测序的方法,从基因层面真正地揭示上述机制,为临床研究提供新思路。第一部分环孢霉素A对脑出血小鼠模型脑损伤的保护研究目的:明确Cs A对IV型胶原酶诱导的ICH小鼠脑损伤的保护作用研究方法:ICH组小鼠为IV型胶原酶诱导的ICH小鼠,Cs A+ICH组小鼠为Cs A治疗的ICH小鼠,NC（Normal Control）组小组为空白对照,每组小鼠为9只。Cs A在术后即刻和术后24h分两次分别以10mg/kg的剂量通过腹腔注射到小鼠的体内。ICH组小鼠、Cs A+ICH组小鼠及NC组在术后24h和48h进行神经功能评估,通过HE染色明确血肿的形成,并通过免疫荧光染色明确组间神经元、小胶质细胞、中性粒细胞和星形胶质细胞的数量差异。采用SPSS17.0软件进行统计学分析,P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果:三组小鼠的死亡率均为0。ICH组和ICH+Cs A组小鼠在手术后苏醒的即刻即出现了明显的神经功能缺损。ICH组在术后24h（2±0 vs 0）及48h（2±0 vs 0）的Bederson评分均高于NC组,结果有统计学差异（P＜0.05）;而ICH+Cs A组在术后24h（1.3±0.6 vs 2±0）及48h（1.7±0.6 vs 2±0）的Bederson评分均低于ICH组,结果有统计学差异（P＜0.05）。ICH组在术后24h（5.0±1.1 vs 0）及48h（8±0.9 vs 0）的Clark一般功能损伤评分均高于NC组,结果有统计学差异（P＜0.05）;而ICH+Cs A组在术后24h（4±1 vs 5.0±1.1）及48h（6±2 vs 8±0.9）的Clark一般功能损伤评分均低于ICH组,结果有统计学差异（P＜0.05）。ICH组在术后24h（11±1.3 vs 0）及48h（14.3±1.1 vs 0）的Clark局灶功能损伤评分均高于NC组,结果有统计学差异（P＜0.05）;而ICH+Cs A组在术后24h（9±1.7 vs 11±1.3）及48h（11±2.7 vs 14.3±1.1）的Clark局灶功能损伤评分均低于ICH组,结果有统计学差异（P＜0.05）。ICH组小鼠处死取脑后,沿针孔冠状剖开可见到明显的血肿,HE（Hematoxylin-Eosin,伊红）染色为典型的出血改变。免疫荧光染色发现,ICH组和NC组相比,神经元数量显著下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;ICH+Cs A组和ICH组相比,神经元数量多,差异有统计学意义（P＜0.05）。ICH组和NC组相比,小胶质细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞数量均显著上升,差异有统计学意义（P＜0.05）;ICH+Cs A组和ICH组相比,小胶质细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞的数量均减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:使用IV型胶原酶0.075U进行小鼠右侧基底节区注射可造脑出血小鼠模型,造模成功率高,死亡率低。小鼠脑组织HE染色显示:ICH组和ICH+Cs A组的血肿形成显著,出血液化明显。ICH小鼠和ICH+Cs A小鼠在术后出现明显的神经功能缺损。ICH+Cs A小鼠的Bederson评分、Clark一般功能损伤评分及Clark局灶功能损伤评分较ICH小鼠改善。ICH小鼠存活神经元的数量减少,活化的小胶质细胞、中性粒细胞和星形胶质细胞数量增多。ICH小鼠在注射Cs A后,存活的神经元细胞较ICH组增多,活化的小胶质细胞、中性粒细胞和星形胶质细胞数量较ICH组减少。神经功能评估结果及免疫荧光结果均证明了Cs A对胶原酶诱导的小鼠ICH后脑损伤的有保护作用。第二部分极微量RNA测序研究环孢霉素A对脑出血后神经细胞转录组的影响及其保护作用机制研究目的:明确ICH组、ICH+Cs A组及对照组三组间神经元与细胞死亡相关的基因变化,明确ICH组、ICH+Cs A组及对照组三组间小胶质细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞与免疫自噬相关的基因变化,从而探讨Cs A的保护机制。研究方法:选取NC组小鼠、ICH组小鼠和ICH+Cs A组小鼠,每组3只。通过流式细胞的方法分别取各小鼠血肿周围的神经元细胞200个,小胶质细胞200个,中性粒细胞200个和星形胶质细胞200个,利用单细胞测序的原理进行极微量RNA测序。对比组间神经元与细胞死亡相关的基因变化,小胶质细胞、中性粒细胞、星形胶质细胞与免疫自噬相关的基因变化。利用DAVID（the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,用于注释、可视化和集成发现的数据库）以及GSEA（Gene Set Enrichment Analysis,基因集富集分析）这两种工具分析KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书）pathway,观测基因富集通路、目标基因对应的蛋白及相互关系,利用Fisher T-test来对数据有效性进行检验,将P＜0.05的pathway进行重点分析。研究结果:在神经元中,我们发现关键通路Apoptosis和Lysosome,发现三个趋势基因DFFB、ATP6V0C和CTSS:DFFB、ATP6V0C和CTSS的转录水平在ICH后显著上调,Cs A能够明显降低ICH后DFFB、ATP6V0C和CTSS的转录。在小胶质细胞中,我们发现关键通路Natural killer cell mediated cytotoxicity和Jak-STAT signaling pathway,发现一个趋势基因IFNB1:IFNB1的转录水平在ICH后显著上调,Cs A能够明显降低ICH后IFNB1的转录;同时发现关键通路Regulation of autophagy和Jak-STAT signaling pathway,发现两个趋势基因IFNA5和IFNA6:IFNA5和IFNA6的转录水平在ICH后显著上调,Cs A能够明显降低IC H后IFNA5和IFNA6的转录。在中性粒细胞中,我们发现关键通路Natural killer cell mediated cytotoxicity,发现三个趋势基因ICAM1、IFNB1、FC ER1G:ICAM1、IFNB1和FC ER1G的转录水平在ICH后显著上调,Cs A能够明显降低ICH后ICAM1、IFNB1和FCER1G的转录。在星形胶质细胞中,我们发现关键通路Systemic lupus erythematosus,发现一个趋势基因TNF（Tumor Necrosis Factor,肿瘤坏死因子）:TNF的转录水平在ICH后显著上调,Cs A能够明显降低ICH后TNF的转录。结论:IV型胶原酶诱导小鼠脑出血后,出现神经功能缺损,神经元死亡,炎性细胞增生活化,神经元中和细胞死亡相关的基因上调,炎性细胞中和免疫自噬相关的基因也出现上调;ICH小鼠使用Cs A治疗后,神经功能缺损减轻,神经元死亡减少,炎性细胞增生活化减弱,神经元中和细胞死亡相关的基因上调程度减弱,炎性细胞中和免疫自噬相关的基因上调程度也减弱。从基因-细胞-功能均证实了Cs A在ICH小鼠中的神经保护作用。