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N-糖基化是自然界发现的最丰富的蛋白质修饰形式之一,其初始步骤为多萜醇寡糖前体的合成,糖基转移酶Alg11作为多萜醇寡糖前体的合成途径中一个重要蛋白,功能为催化甘露糖转移到底物DPGn2M3(Dolichyl-pyrophosphate-GlcNAc2Mannose3)上进而生成DPGn2M4和DPGn2M5这两种多萜醇寡糖前体的反应。DPGn2M5对研究翻转酶(Flipase)如何将其翻转进入内质网内腔进行更多的糖基修饰具有重要意义。在人体中糖基转移酶Alg11的缺陷会导致罕见的先天性糖基化病(Congenital disorders of glycosylation,CDG),但目前还没有一种方法能够建立不同的突变与疾病严重程度之间的相关性。本研究在原核表达系统中表达酵母来源的糖基转移酶Alg11,并对其进行可溶性表达,在体外进行了其酶学性质的初步研究并建立体外定量检测Alg蛋白活性的方法。首先通过对酿酒酵母Alg11的蛋白质跨膜域结构进行分析,设计了去除跨膜域的蛋白Alg1145-548并在大肠杆菌Rosetta中表达,经过蛋白纯化可得到可溶性蛋白Alg1145-548。以PPGn2(Phytanyl-pyrophosphate-GlcNAc2)为底物,酶法快速高效地合成出Alg11的天然底物类似物PPGn2M3。用Alg1145-548催化转糖基反应,证实Alg1145-548蛋白具有催化PPGn2M3生成PPGn2M4和PPGn2M5的糖基转移酶活性。产物PPGn2M5通过不同的甘露糖苷酶酶切反应,验证了两个新加上的甘露糖以α-1,2糖苷键的形式连接到底物PPGn2M3上。最终在体外成功表达纯化具有糖基转移酶活性的酿酒酵母Alg11。本文进一步对糖基转移转移酶Alg11酶学性质进行体外研究。结果显示:最适反应温度为30oC,最适金属离子为Ca2+,最适底物供体为GDP-Man,最适反应pH为9.0,最适底物受体为PPGn2M3,受体中的脂肪链结构对酶识别底物起到重要作用。通过同源序列比对发现糖基转移酶Alg11中聚甘氨酸和EX7E两个保守区域,G85V、E405A和E413A三个突变都会导致酶活性丧失,G84V突变对酶活性无影响;在体外证明Alg1、Alg2和Alg11具有特定催化顺序,任意一种酶的缺失可以导致反应的终止。该特性保证了N-糖基化中多萜醇寡糖前体的有序合成。在原核表达系统中表达人糖基转移酶hAlg11,利用定量检测酿酒酵母Alg11的方法检测hAlg11活性,证明hAlg11具有糖基转移酶活性。选取ALG11-CDG病人的2个突变位点L86S和Q318P,在体外定量分析突变位点对酶活性影响,结果显示突变体相对活性与病人症状严重程度相吻合。综上所述,体外定量检测hAlg11酶活性的方法可以应用于判断ALG11-CDG病人疾病的严重程度。