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背景心血管系统疾病已然成为威胁人类健康的头号杀手。病态窦房结综合征（Sick sinus syndrome,SSS）是临床常见的严重心脏病之一,甚至增加死亡风险。目前,电子起搏器是窦房结功能障碍（Sinusnodedysfunction,SND）或SSS患者的一线治疗方案。电子起搏器虽然有效,但目前的电子设备存在电极导线或发生器故障、缺乏自主响应、与强磁场相互干扰以及设备相关感染等诸多局限性。通过体细胞基因转染、细胞融合或细胞移植产生的生物起搏器为电子起搏器提供了一种替代方法。体细胞重编程策略,包括基因编码转录因子转染,将工作心肌细胞转化为窦房结起搏样细胞。即使无导线起搏器变得更小、侵入性损伤更小,生物起搏器仍有望扩展传导系统疾病治疗潜能。由超极化激活环核苷酸门控通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN）基因产生的If电流即起搏电流是舒张期缓慢去极化的关键。HCN4是HCN的主要亚型,该通道突变会导致SND。另外,矮小同源盒基因（Short stature homeobox-containing gene,Shox2）对窦房结细胞的发育和分化同样重要。敲除Shox2小鼠由于Nkx2.5、Cx40和Cx43的表达增加以及HCN4、Tbx3和Isl1的表达下调而死于 SSS。与成人骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）不同,人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs）具有更易获得,成本低,免疫原性弱和良好增殖活力等优势,为后续研究及临床应用提供更好的基础。长期以来,本课题组致力于干细胞再生医学研究,具有通过体外转染起搏基因诱导BMSCs分化为起搏样细胞等相关研究基础,因此,本实验为进一步探索生物起搏样细胞转化效率,拟通过慢病毒载体单独或联合转染Shox2、HCN4基因至HUCMSCs的可行性及效果。研究方法1.进行HUCMSCs体外培养,镜下观察不同培养代数HUCMSCs的形态和增殖特性变化。2.慢病毒载体构建:分别构建pLentis-Ubi-MCS-增强型红色荧光蛋白（ERFP）-HCN4和pLentis-Ubi-MCS-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-Shox2病毒载体,及pLentis-Ubi-MCS-ERFP和pLentis-Ubi-MCS-EGFP空载体;载体内携带puro抗性基因用于稳转细胞株筛选。3.确定慢病毒对细胞感染的最佳病毒感染复数（MOI）值和条件。将构建好的慢病毒载体分别转染至第7代生长良好的HUCMSCs,分为以下四组:①对照组（GFP/RFP组）②Shox2-MSCs组③HCN4-MSCs组④联合转染Shox2-HCN4-MSCs组;嘌呤霉素筛选稳定株HUCMSCs。4.转染后的各组细胞进行检测:①CCK8检测各组细胞增殖情况;②显微镜下观察各组细胞荧光表达量及形态变化;③分别运用荧光定量PCR、Western blotting方法检测相关基因mRNA和蛋白表达水平,如:Cx43、HCN4、Nkx2.5等。结果1.P5代HUCMSCs复苏后状态良好,贴壁24h后显微镜下观察呈典型旋涡状集落单位生长。2天左右可长满瓶底约80-90%面积,形态饱满,增殖能力强;该细胞体外培养至P20仍保持良好增殖特性。2.慢病毒过表达载体构建成功。实验中经梯度法转染,当MOI=250转染Shox2-MSCs组（GFP）和HCN4-MSCs组（RFP）转染效率约为50-60%。实验组细胞随着培养时间延长荧光表达量继续有所增加,形态较前也稍有变化,折光性较好。进行共转染时,镜下观察细胞生长状态良好,共转染效率约40-50%。3.细胞增殖能力检测:通过CCK8法检测不同组细胞生长情况,与对照组相比,Shox2-MSCs组和HCN4-MSCs组细胞生长速度明显减慢（p＜0.05）,而共转染Shox2-HCN4-MSCs组细胞生长速度更缓慢（p＜0.01）。4.细胞分子水平检测:（1）mRNA 水平:Shox2-MSCs 组和 Shox2-HCN4-MSCs 组中 HCN4、Tbx18、Tbx3 mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05）,Nkx2.5、Cx43的表达量显著低于对照组（p＜0.01）;HCN4-MSCs组和对照组之间Tbx3、Cx43、Nkx2.5mRNA表达量有统计学差异（p＜0.05）;Shox2-HCN4-MSCs组中上述因子mRNA表达量与Shox2-MSCs组、HCN4-MSCs组相比有统计学差异（p＜0.05）;（2）蛋白水平:与对照组相比,Shox2-MSCs组Cx45蛋白水平上调以及Nkx2.5、Cx43蛋白水平下调（p＜0.01）,HCN4-MSCs组检测到Cx45和Cx43蛋白表达。Shox2-HCN4-MSCs 组比 Shox2-MSCs 组和 HCN4-MSCs 组上（或）下调更显著（p＜0.001）。结论1.永生化HUCMSCs体外传代培养至20代仍保持典型的形态特点和良好的增殖性能,为后续研究稳定有效的心脏起搏样细胞构建奠定了良好特性的种子细胞基础。2.通过慢病毒重组载体成功将Shox2/HCN4单独或共同转染入永生化HUCMSCs,为下一步研究产生稳定的起搏样细胞表型提供了保障。3.Shox2、HCN4作为单一因子或以组合的形式转染HUCMSCs后可促进其向心脏起搏样细胞表型分化,在mRNA和蛋白水平检测到起搏促进基因HCN4、Shox2、Tbx3和Cx45表达量明显上调,起搏抑制基因Nkx2.5及Cx43的表达量明显下调。与单个基因转染相比,联合转染组上述起搏基因表达进一步上调,而起搏抑制基因Nkx2.5、Cx43的表达进一步下调,共转染组有促进HUCMSCs向起搏样细胞转化的叠加效果。有力支持了我们通过外源性目的基因联合转染HUCMSCs诱导生物起搏样细胞生成策略的可行性和有效性。