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禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIVs）是正黏病毒科,A型流感病毒属的RNA病毒,其感染宿主谱广、变异快、疫苗需不断更新;而且随着规模化养殖场大量使用抗病毒药物,导致耐药性问题愈加明显。因此,研发潜在的广谱抗病毒药物就成了亟待解决的科学问题。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）可通过调控基因的表达模式,重塑细胞微环境,从而调控病毒复制。本实验室前期基于RNA-seq技术和功能验证成功筛选到了一个潜在功能性LncRNA,NONMMUT011061（简称Lnc#61）。研究发现Lnc#61具有潜在的广谱抗流感病毒作用,能够抑制包括H1N1、H5N1、H7N9等在内的多种亚型AIVs的复制,且在病毒进入、早期及中后期复制阶段都发挥作用。本研究将进一步探索Lnc#61广谱抗流感病毒的作用机制,以期为研发新型的广谱抗病毒药物或疫苗奠定基础。1.Lnc#61及其功能域所调控宿主因子的筛选及验证为了初步筛选Lnc#61发挥广谱抗病毒活性时的关键宿主因子,本研究借助RNA-seq技术系统分析了CK10（A/Chicken/Jiangsu/k0402/2010,H5N1）病毒感染或未感染293T细胞后Lnc#61调控宿主细胞应答的差异转录组学。结果表明,过表达Lnc#61后,感染组诱导的差异基因数显著多于未感染组,且两组间只有127个共有基因。此外,在不感染病毒的情况下,过表达Lnc#61显著诱导宿主炎症反应相关基因的差异表达;而在感染病毒后,Lnc#61则显著调节花生四烯酸、细胞死亡、炎症反应等生物过程。qRT-PCR验证发现病毒感染后,Lnc#61显著促进细胞花生四烯酸代谢相关基因（ALOX5、CYP4F2）、细胞死亡相关基因（AEN、INPP5D、NLRP3）、抗病毒基因（IRGM、IKBKE、IFIT2）的表达,显著抑制炎性细胞因子（CXCL8、IL18、IL17C）的表达,验证结果与RNA-seq结果一致。此外,Lnc#61的功能区C和I介导了 Lnc#61的抗病毒作用并参与Lnc#61对关键细胞因子的调控。2.Lnc#61靶向调控宿主因子相关细胞表型的验证为了进一步探究Lnc#61发挥广谱抗AIVs的作用机制,接下来对前一章节筛选到的Lnc#61靶向的关键宿主因子的相关细胞表型进行验证。首先,借助单荧光素酶报告系统、qRT-PCR实验对IFN-β的表达量进行检测,发现Lnc#61不影响IFN-β的表达,说明Lnc#61不依赖IFN-β途径抑制病毒复制;接着验证了Lnc#61对细胞死亡的调控:发现在病毒感染12 h时,Lnc#61显著促进细胞凋亡;而在病毒感染24h时,Lnc#61则会显著抑制细胞凋亡;此外,Lnc#61显著调控各类细胞的焦亡,尤其是MDCK细胞,表现为无论感染病毒与否,Lnc#61均显著促进MDCK细胞的焦亡,且抑制MDCK细胞焦亡后会显著促进病毒复制。接着又借助靶向代谢组学技术,检测了病毒感染情况下,Lnc#61对于细胞花生四烯酸代谢的调控作用,发现Lnc#61 显著提高9S-HODE、12S-HETE、13S-HODE、15S-HETE、ARA、DHA等花生四烯酸、亚油酸代谢通路中产物的表达。综上所述,推测Lnc#61可能通过调节宿主细胞凋亡、焦亡以及花生四烯酸代谢过程抑制病毒复制。3.Lnc#61互作病毒蛋白和宿主蛋白的筛选与功能验证为了筛选Lnc#61发挥抗病毒作用的靶向病毒蛋白,将CK10病毒的9个质粒（PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M、NS和PA-X）分别转染RLE-6TN细胞。结果发现,在不感染病毒的情况下,PA-X会显著抑制Lnc#61的内源性表达（Foldchange＜-1.5）;而在感染病毒的情况下,PA、NS、M、NP、NA、PB1、PA-X均会显著抑制内源性Lnc#61的表达（Fold change＜-1.5）;接着又将病毒质粒与Lnc#61质粒共转染293T细胞,发现NA、M、PA、PB1、PA-X（Foldchange＜-1.5）会显著抑制异位Lnc#61的表达而HA会显著促进异位Lnc#61的表达（Fold change＞1.5）。最后,从中选取了HA、PB1、PA-X基因进行下一步实验。实验结果表明,PA-X会显著提高Lnc#61的抗病毒效果并显著影响Lnc#61调控的细胞死亡、炎症以及花生四烯酸代谢相关基因的表达;PB1蛋白会显著削弱Lnc#61的抗病毒效果且显著影响Lnc#61调控的凋亡及炎症相关细胞因子的表达;而HA则对Lnc#61调控的病毒复制无影响,且对Lnc#61所调控的凋亡（INPP5D）以及炎症（IL-18）细胞因子的表达也无显著影响。此外,RIP实验和EMSA实验均证明Lnc61可与PA-X互作。进一步地研究发现PA-X显著影响Lnc#61对细胞凋亡和细胞焦亡的调控,推测Lnc#61可通过与PA-X互作调控细胞凋亡和细胞焦亡进而抑制病毒复制。此外,RNA Pull-down、质谱技术、Western Blot实验结果均表明,Lnc#61可能与hnRNPQ宿主蛋白互作,推测Lnc#61可能与hnRNPQ互作参与调控流感病毒的复制。综上所述,本研究初步探索了 Lnc#61的广谱抗AIVs作用机制。本研究一方面充实了我们对长链非编码RNA在流感病毒感染过程中的作用及相关分子机制的了解;另一方面,也为广谱抗病毒药物靶点的筛选奠定了理论基础。