新城疫（ND）是一种具有高度传染性的禽类病毒病,由新城疫病病毒（NDV）所致,主要引起精神萎顿、高热、神经紊乱、呼吸困难等临床特征。NDV属于禽副黏病毒科Ⅰ型,副黏病毒已被证明可以通过多种途径进入细胞,除了通过膜融合外,还可以通过内吞作用感染宿主,例如呼吸道合胞病毒可以通过小窝蛋白介导的内吞作用（CavME）进入树突状细胞。不同的病毒以不同的方法感染宿主细胞,同一病毒也可通过多种途径侵入细胞。病毒感染巨噬细胞后使巨噬细胞活化转化为抗原递呈细胞,增强适应性免疫反应,促进病原的清除。因此本研究以鸡巨噬细胞HD11为模型,探究NDV进入HD11的途径,有助于开发不同类型的治疗策略。首先用NDV中等毒力疫苗株NDV Mukteswar（5 MOI）感染HD11细胞,通过半数组织培养感染剂量（Median tissue culture infective dose,TCID50）、间接免疫荧光实验（Immunofluorescence assay,IFA）和蛋白质印迹法（Western Blot,WB）发现 NDV 可以感染HD11细胞。为了确定NDV以何种途径感染HD11细胞,选择Wortmannin（PI3K 抑制剂）、5-（N-methyl-N-isobutyl）amiloride（NHE 抑制剂）、Jasplakinolide（F-actin聚合诱导剂）、Phorbol-12-myristate-13-acetate（PKC激活剂）和Rottlerin（PKC抑制剂）等多种药物预处理HD11细胞后再感染NDV Mukteswar毒株,通过WB和IFA检测其对病毒感染细胞是否有影响。结果显示巨胞饮途径相关药物处理对NP蛋白的表达无影响,因此初步认定NDV进入HD11细胞不通过巨胞饮途径。通过使用Dynasore（dynamin抑制剂）预处理细胞后再感染NDV Mukteswar毒株,发现能显著够抑制病毒的感染,说明NDV进入HD11细胞依赖于发动蛋白（dynamin）。考虑到dynamin同时参与了网格蛋白介导（CME）和小窝蛋白介导的内吞（CavME）的内吞,因此使用了 Chlorpromazine（clathrin特异性抑制剂）预处理细胞,结果发现对NDV感染细胞无影响,说明NDV不依赖CME途径进入HD11细胞。然而CavME相关抑制剂MβCD（胆固醇去除剂）、Nystatin（胆固醇结合剂）能抑制NDV感染HD11细胞,表明NDV进入HD11细胞依赖于胆固醇。进一步使用MβCD处理细胞并感染NDV,RT-qPCR检测发现,与仅接毒组相比,Caveolin-1的mRNA水平降低（P＜0.01）,表明MβCD的使用会降低细胞中的Caveolin-1。鉴于Caveolin-1是小窝的重要组成成分,也是其标志蛋白,通过siRNA敲低HD11细胞内Caveolin-1表达后,发现NDV复制水平显著降低。通过构建Caveolin-1的真核表达载体,分别与NDV HN和F蛋白的重组质粒共转HEK293T细胞,Co-IP实验结果显示Caveolin-1与HN、F蛋白均存在蛋白互作关系。表明NDV依赖于CavME途径进入HD11细胞。Rab蛋白（Ras analog in brain proteins）,是一种以单体形式存在的小GTP结合蛋白,对于囊泡的形成、运输和融合至关重要。Rab5和Rab7蛋白是囊泡转运到早期和晚期内体的关键调节因子。Rab11主要定位于核周再循环内体,并调节慢速再循环途径。为进一步探究NDV通过内吞途径进入宿主细胞后,内体相关的Rab蛋白在NDV转运过程中的功能。构建了 Rab5a、Rab7和Rab11的真核表达载体,以及Rab5a、Rab7 的显性失活突变体（Dominant negative mutant,DN）Rab5a（S34N）、Rab7（T22N）。过表达Rab5a、Rab7真核表达载体及其突变体发现Rab5a（S34N）能抑制NDV感染,而Rab7（T22N）对NDV的感染没有抑制作用。并且过表达Rab11发现可以促进NDV感染。结果表明,NDV感染HD11细胞需要Rab5和Rab11的参与,这表明NDV从早期内体转运到再循环内体,而不是晚期内体,这可能导致NDV核衣壳释放到细胞质中,从而导致逃逸宿主免疫应答。综上所述,本研究发现NDV可以通过CavME途径感染HD11细胞,并通过早期内体转运到再循环内体后进入胞质,进而进一步开始新的感染周期。