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β-玉米赤霉烯醇(β-Zearalenol,β-ZOL)是玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)在动物体内代谢形成的主要衍生物之一。β-ZOL和ZEA一样,具有雌激素样活性,对动物有较强的生殖毒性,此外还有细胞毒性、免疫毒性和遗传毒性等。β-ZOL也是ZEA在动物体内的主要残留物之一,直接影响动物源性食品的品质和安全。因此,有必要建立一种快速准确的检测β-ZOL的方法,以检测动物源性食品中β-ZOL的残留。本试验通过活性酯法将小分子β-ZOL与蛋白质载体偶联合成人工完全抗原,纯化鉴定后免疫BALB/c小鼠,利用单克隆抗体制备技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测技术,制备了针对β-ZOL的效价高、特异性好的单克隆抗体,并以此为基础建立了 β-ZOL的间接竞争ELISA(CiELISA)检测方法。1、β-ZOL人工完全抗原的合成与鉴定。β-ZOL属于半抗原,其分子结构中不含有羧基和氨基,本试验先通过化学反应对β-ZOL分子结构进行改造,引入羧基,再利用活性酯法将改造后的半抗原β-ZOL与大分子载体蛋白BSA、OVA偶联合成了完全抗原。通过紫外扫描法、SDS-PAGE法和免疫学方法对合成物进行了鉴定,结果表明β-ZOL与载体蛋白偶联成功。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测了人工合成完全抗原的浓度,结果,合成的β-ZOL-BSA和β-ZOL-OVA的浓度分别为2.6 mg/mL 和 3.2mg/mL。2、β-ZOL单克隆抗体的制备。以β-ZOL-BSA作为免疫原,β-ZOL-OVA作为包被原,按照常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,五免后7d检测小鼠血清效价达1:10000以上。加强免疫3d后,取免疫效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经过ELISA法和有限稀释法筛选,获得一株稳定分泌抗β-ZOL抗体的细胞株1F5。采用小鼠体内诱生法制备腹水,利用1F5杂交瘤细胞株制备了抗β-ZOL抗体的腹水11mL,测得腹水的蛋白浓度为44.48 mg/mL。3、CiELISA检测方法的建立。利用1F5单克隆抗体建立检测β-ZOL残留的间接竞争ELISA方法。包被原最佳稀释浓度1:1000,1F5抗体的工作浓度1:8000,β-ZOL的药物抑制标准曲线表明在浓度为5～500ng/mL时,标准曲线线性关系良好,线性方程为y=0.4063x-0.2042(R2=0.9904),IC50为53.19ng/mL,LOD为6ng/mL,LOQ为26.39ng/mL。单抗特异性试验结果表明,该单抗对β-ZOL的抑制率为100%,与α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、β-雌二醇(β-estradiol)、呕吐毒素(DON)、伏马毒素B1(FB1)等无交叉反应。4、回收试验。用牛奶样品进行β-ZOL添加回收试验,牛奶样品稀释8倍时可基本消除基质干扰,线性范围 5～500ng/mL,曲线标准方程为 y=0.3749x-0.1668(R2=0.9949),IC50为 59.35ng/mL,LOD 为 6.57ng/mL,LOQ 为 57.47ng/mL。用 10、100、400ng/mL 的β-ZOL 标准液做添加回收试验,结果牛奶样品β-ZOL的添加回收率在91.24%～110.07%之间,变异系数在6.17%～8.73%之间。结论:采用单克隆抗体制备技术和ELISA检测技术制备了 β-ZOL的单克隆抗体,并建立了检测β-ZOL的CiELISA方法,经检测制备的单抗特异性良好,检测范围5～500ng/mL,IC50为53.19ng/mL。牛奶加标回收试验表明,建立的检测β-ZOL的CiELISA方法稳定可靠。