论文部分内容阅读
烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）是影响世界粮食作物的主要病毒,能侵染世界上所有烟草和包括葫芦科、十字花科等在内的多种植物,一旦发生极难控制。本研究旨在解析IP-L对其互作蛋白NbAS-B、NbCML30和RIN4功能的影响,明确IP-L作为病毒外壳蛋白和寄主抗性因子的连接点,阐明其如何调控病毒侵染,又是如何诱导寄主产生抗病性。首先,基于之前的研究,利用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）和荧光素酶互补技术（Luciferase Complementation Assay,LCA）进一步验证了IP-L与天冬酰胺合成酶NbAS-B的互作,并且IP-L与NbAS-B共定位于细胞质和细胞核。共沉默IP-L和NbAS-B后TMV-GFP侵染加快,表明沉默NbAS-B克服了沉默IP-L抑制TMV-GFP侵染的功能。进一步发现IP-L能稳定并促进NbAS-B的表达,而NbAS-B具有天冬酰胺合成酶活性,能诱导天冬酰胺（Asparagine,ASN）的生物合成。此外,天冬酰胺也能显著抑制TMV-GFP侵染。之后,我们发现沉默NbAS-B显著抑制了水杨酸（salicylic acid,SA）途径相关基因PR1和PR2的表达,而外施ASN则显著增强了PR1和PR2的表达,并且外施水杨酸甲酯（Methyl salicylate,Me SA）能诱导NbAS-B的上调表达,然而在水杨酸缺失的转基因植株Nah G中外施ASN后丧失了其抗病毒功能,综合表明NbAS-B-ASN通过诱导水杨酸参与了寄主抗性反应。因此,本部分揭示IP-L与NbAS-B互作后,IP-L稳定并促进NbAS-B的表达,进而影响其天冬酰胺合成酶功能,调控天冬酰胺的生物合成,介导水杨酸信号途径参与寄主抗病毒防御。在前期研究发现IP-L与NbCML30在细胞质和细胞核互作的基础上,首先通过Co-IP再次验证了二者的互作,且花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaic virus,Ca MV）35S启动子驱动的稳定表达NbCML30的转基因植株表现出对TMV-GFP、TMV U1侵染的强烈抑制作用,然而酵母双杂交（yeast two hybrid,Y2H）表明NbCML30与TMV的CP和MP并不互作。利用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）介导的共沉默技术同时沉默IP-L和NbCML30,发现共沉默后TMV-GFP侵染减弱,表明IP-L在其中起主导作用,但在NbCML30过表达植株中外施钙离子抑制剂氯化镧（La Cl3）后其抗病毒功能丧失,表明NbCML30的抗病功能依赖于钙信号。钙信号能促进IP-L与NbCML30的互作,但IP-L过表达植株中NbCML30的表达受到抑制,且IP-L能通过26S蛋白酶体/泛素化途径降解NbCML30。利用q PCR检测发现NbCML30过表达后氧化还原途径相关基因AOX、AAO、GST和PARA的表达显著上升,并且DAB染色表明NbCML30过表达显著增强了活性氧（reactive oxygen species,ROS）迸发,且显著增加了抗氧化相关酶CAT、POD和SOD活性,但这种激活在外施La Cl3均受到抑制,表明NbCML30过表达通过激活钙信号显著激活了植物抗氧化途径。本部分揭示了一个新的病毒蛋白操控钙离子模型:TMV CP,一个不具有任何沉默抑制子功能的病毒蛋白,在与IP-L互作之后,抑制了NbCML30的表达,进而降低NbCML30的钙依赖性抗病毒功能,影响氧化还原途径,进一步促进病毒侵染。RIN4是被广泛研究的免疫因子,其作为目前鉴定的唯一同时参与PTI和ETI防御的蛋白,被多个效应蛋白识别并修饰,从而引起一系列防御反应。之前的研究表明IP-L和RIN4在体内外互作,本部分首先利用Co-IP和LCA试验再次证明IP-L和RIN4互作,并且RIN4保守结构域Avr Rpt参与了其与IP-L的互作。RIN4定位在细胞膜,与IP-L共定位于细胞膜。TMV、Tu MV、TRV和PVX侵染不同程度激活了RIN4,且TMV侵染后RIN4上升表达最为显著,但TMV MP和CP并不与RIN4互作。Ca MV 35S驱动的RIN4过表达转基因本氏烟表现出对TMV-GFP侵染的促进作用。共沉默IP-L和RIN4表现出更强的抑制TMV-GFP侵染的功能,而共表达二者却能显著促进TMV-GFP侵染,抑制PTI防御过程中的胼胝质沉积以及ROS迸发,表明IP-L和RIN4协同作用逃逸PTI防御后促进病毒侵染。Avr Rpt对RIN4的毒力以及膜定位并无影响。IP-L能引起RIN4磷酸化,而RIN4磷酸化会引起下游RPM1的识别。RPM1定位于细胞质和自噬体,且TMV侵染显著增强了其表达,而TRV介导的RPM1沉默促进了TMV-GFP侵染,表明RPM1在抗TMV防御中起正调控作用。本部分结果表明,TMV CP挟持IP-L以磷酸化RIN4,进而抑制PTI防御,共同促进TMV侵染。然而,磷酸化的RIN4被下游RPM1识别,从而引起RPM1介导的抗病毒防御,以抑制TMV进一步侵染。本研究揭示了以IP-L为核心的植物免疫调控互作链,IP-L与TMV CP互作进而被病毒挟持,从而影响下游一系列免疫防御反应,最终促进病毒侵染或激活免疫反应。解析以IP-L为核心的病毒侵染调控链,对于理解病毒的致病性、寄主的抗病性及抗病毒作物的遗传育种至关重要。