青枯菌效应蛋白RipAW生物功能和作用机制的研究

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番茄是我国农业中重要的蔬菜之一。青枯病是番茄种植过程中经常出现的土传细菌病害,寄主范围广泛,传播速度快,对番茄产生的危害大,难以防治。青枯菌(Ralstonia solanacearum)Ⅲ型分泌系统是产生致病性的关键毒性因子,相关的效应蛋白可以抑制植物的先天免疫或调控寄主生理代谢,对于细菌的致病过程非常重要,因此研究青枯菌效应蛋白的作用机制有重要意义。本论文针对青枯菌效应蛋白RipAW的生物功能展开研究,探讨该蛋白与植物互作的分子机制,能够增强对青枯菌致病和植物抗病机制的认识,以期为抗病育种提供理论基础。分析青枯菌效应蛋白RipAW的氨基酸序列,发现其含有新型的E3泛素连接酶NEL结构域,通过大肠杆菌体内泛素化系统证明了RipAW具有自泛素化活性;本氏烟叶片瞬时表达RipAW,早期可以抑制flg22触发的活性氧爆发,晚期可以引起叶片过敏性坏死反应;然而突变NEL结构域第177位半胱氨酸后,则丧失了诱导细胞死亡和抑制活性氧爆发的能力;效应蛋白RipAW定位于细胞膜与细胞核,突变了潜在的核定位信号位点后,引起本氏烟叶片的细胞死亡的能力显著减弱。获得了RipAW的敲除突变体,发现突变体对番茄和拟南芥的致病力有所增强,细菌生长量较野生型菌株GMI1000显著增多,暗示该效应蛋白可能会触发寄主免疫反应。为了进一步研究RipAW和植物的互作机制,构建了超量表达RipAW的转基因拟南芥,发现转基因拟南芥后代植株矮小叶片卷曲,免疫相关基因上调表达;超表达酶学活性位点和核定位信号位点突变体的转基因拟南芥,则没有相关的自我免疫表型;选取植物免疫反应的关键蛋白筛选拟南芥中参与RipAW引起的自我免疫的信号元件,获得了在eds1、pad4、ndr1、adr1、nrg1和helperless突变体背景下超量表达RipAW的转基因植株,发现这些信号元件突变后均不能抑制RipAW引起的自我免疫表型;通过免疫共沉淀和蛋白质质谱鉴定了拟南芥和烟草中的潜在和RipAW互作的靶标蛋白,初步验证了RipAW可以降解的候选蛋白。综上所述,本研究发现青枯菌效应蛋白RipAW对其致病力有负调控作用,能够触发多种植物的免疫反应和细胞死亡,暗示植物中存在识别RipAW的免疫受体,初步探讨了RipAW激活拟南芥自我免疫的信号途径,为进一步了解植物-病原体相互作用的机制提供了新的线索。
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