脂质代谢是昆虫生命的基础,为昆虫的生殖、发育和飞行等重要生理过程提供能量,而生殖发育的正常进行是昆虫种群繁衍的必要条件。目前对于昆虫代谢和生殖的研究主要集中于转录水平上的基因调控。microRNAs（miRNAs）是一类保守的非编码RNA,在转录后基因调控中发挥重要作用,近年来在昆虫中已有广泛报道。橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种入侵性极强的检疫性害虫,因此,研究参与调控橘小实蝇代谢和生殖的miRNA并明确其调控机制,不仅有助于加深我们对昆虫代谢和生殖发育分子机制的了解,而且为橘小实蝇的绿色可持续治理提供新途径和新思路。本研究首先得到了橘小实蝇雌成虫脂肪体组织中不同生殖发育阶段差异表达的miRNA-miR-2b-2-5p;显微注射miRNA抑制剂和类似物,通过检测代谢水平、脂质代谢相关基因表达量、卵巢发育和生殖力等指标,明确其在代谢和生殖中的功能;进一步通过预测靶基因、双荧光素酶实验、靶基因RNA干扰、饥饿处理等揭示其调控橘小实蝇代谢和生殖发育的分子机理。1.miR-2b-2-5p在橘小实蝇代谢和生殖中的功能研究首先研究了miR-2b-2-5p在橘小实蝇雌成虫不同组织以及脂肪体中不同发育时期的时空表达模式,发现其在脂肪体组织中特异性高表达,并且表达量随着性成熟逐渐升高。然后对羽化第三天的雌成虫显微注射miR-2b-2-5p抑制剂,研究其在代谢和生殖中的功能。结果显示,miR-2b-2-5p表达量被抑制后糖原含量显著上升,甘油三脂含量显著下降,脂肪细胞中脂滴明显减小,分布稀疏,脂质合成基因表达量显著下降,部分脂质分解基因表达量显著上调;卵巢发育延迟,单雌日均产卵量及总产卵量都显著下降,但孵化率和交配竞争率无显著变化;此外,卵黄蛋白原基因Vg1和Vg2表达量极显著下降。同样注射miRNA类似物,发现miR-2b-2-5p过表达后甘油三脂含量显著上升,但不影响糖原水平,脂肪细胞中脂滴明显增大,且有过度堆积现象,脂质合成基因表达量显著上升;生殖检测中同样发现卵巢发育延迟、产卵量显著减少、Vg1和Vg2表达量极显著下降的表型缺陷。以上结果表明miR-2b-2-5p参与调控脂质代谢,通过调节Vg1、Vg2的合成,最终影响生殖发育。2.靶基因筛选与功能研究其次,我们通过Target Scan、miRanda两种软件预测miR-2b-2-5p的靶基因,取交集,共获得13个候选靶基因。qPCR检测注射miR-2b-2-5p抑制剂和类似物后靶基因的表达量变化,发现cyclic AMP response element-binding protein B（CREB）、long-chain fatty acid transport protein 4（LCFA）和uncharacterized LOC105229701（HINT3）三个基因的表达量与miR-2b-2-5p呈现负相关。双荧光素酶实验证实CREB为miR-2b-2-5p的靶基因。进一步利用RNAi敲降CREB研究其功能,结果显示,CREB被沉默后的表型与miR-2b-2-5p过表达时类似,即糖原含量无显著变化,甘油三脂含量显著上升,脂滴增大,脂质合成基因表达量显著上升;卵巢发育延迟,产卵量显著下降;Vg1、Vg2表达量也显著下调。以上结果表明CREB可能通过调控脂质的分解进而调节脂质代谢,最终影响橘小实蝇的生殖发育。3.饥饿处理对代谢水平和卵黄发生的影响最后,为了进一步验证miR-2b-2-5p与靶基因CREB是否参与调控代谢,饥饿处理检测miR-2b-2-5p与CREB的表达量,以及代谢水平和相关基因表达量的变化。结果显示,饥饿处理导致miR-2b-2-5p表达量显著下调,CREB显著上调;糖原含量显著上升,甘油三脂含量显著下降;脂质合成基因表达量显著下降,脂质分解基因表达量显著上升;脂肪体中Vg1、Vg2表达量极显著下调。以上结果进一步验证了miR-2b-2-5p与CREB间的靶向关系,也明确了miR-2b-2-5p通过作用于靶基因CREB从而调控脂质代谢和生殖。综上所述,橘小实蝇miR-2b-2-5p通过靶向CREB来调控脂质代谢,进而影响其生殖发育。本研究不仅丰富和完善了昆虫代谢和生殖的调控机制,也为橘小实蝇的绿色防控提供了有力的理论参考。