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昆虫肠道寄居着各种各样的微生物,肠道微生物影响宿主的生长发育、能量代谢、免疫调节及营养物质的消化吸收等生理功能,同时也影响宿主的运动、生殖、攻击等行为。昆虫的取食行为是机体的营养获得和能量供给途径,对于维持个体生存、种群繁衍具有重要意义。研究发现肠道微生物能够影响昆虫的取食行为,如觅食、取食偏好等,但肠道微生物调控宿主取食行为的分子机制尚不明确。昆虫神经肽是由昆虫的神经系统分泌的多肽类内源活性物质,在生物体内以神经激素、神经递质及神经调质等形式存在,广泛参与调控昆虫的各种生理过程及行为。已有研究表明,多种神经肽在昆虫的取食行为中发挥着重要作用。因此本论文以果蔬害虫橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）为材料,利用微生物学、无菌生物学和RNAi等技术研究肠道微生物对宿主橘小实蝇取食和神经肽基因及其相关代谢物质的影响,并以此为基础研究肠道微生物是否可以通过神经肽调控宿主橘小实蝇的取食及其分子机制。主要研究结果如下:1.肠道共生菌影响橘小实蝇取食量使用抗生素喂食清除橘小实蝇成虫肠道微生物后,肠道总菌丰度下降了97.35%,橘小实蝇取食量也显著下降了 36.06%。分别喂食回补密歇根克雷伯氏菌Klebsiella michiganensis、霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、阿氏肠杆菌Enterobacter asburiae、弗式柠檬酸杆菌Citrobacter freundii、柯氏柠檬酸杆菌Citrobacter koseri 6种肠道共生菌,结果发现,相比于清除肠道微生物橘小实蝇,回补K.michiganensis菌后橘小实蝇的取食量显著提高了 24.01%,恢复到正常种群水平,而回补其他菌株橘小实蝇的取食量无显著恢复,表明肠道微生物的缺乏显著影响橘小实蝇的取食量,其中K.michiganensis是影响橘小实蝇取食量的关键共生菌。为了探索共生菌如何影响橘小实蝇的取食,对清除肠道微生物组试虫分别喂食回补高温灭活的K.michiganensis菌、K.michiganensis 活菌体以及K.michiganensi菌发酵液的上清液,研究其对橘小实蝇取食量的影响。结果发现仅回补活菌组橘小实蝇的取食量有显著恢复,与清除肠道微生物组相比,取食量显著提高44.00%,恢复到与对照组无差异的水平,回补高温灭活的K.michiganensis菌与K.michiganensi菌发酵液的上清液对宿主的取食量无显著影响,表明K.michiganensis活菌体才能影响宿主橘小实蝇的取食。2.肠道共生菌影响神经肽基因表达和章鱼胺物质合成对实验室前期获得的正常和清除肠道微生物的橘小实蝇转录组数据进行分析,筛选得到多种差异神经肽基因,并通过荧光定量PCR对与取食有关的基因进行验证。结果显示,与正常组相比,清除肠道微生物使CCHamide-2（CCH-2）基因表达量显著下调53.02%,CCHamide-2受体（CCHamide-2 Receptor,CCH-2R）基因表达量显著下调52.77%;抑咽侧体激素（Allatostatin-A,Ast-A）基因表达量显著上调30.85%,但Ast-A受体（Allatostatin-A Receptor,Ast-AR）基因表达量无显著变化;章鱼胺受体（Octopamine Receptor,OAR）基因表达量显著上调55.10%,而合成章鱼胺的关键酶基因酪氨酸脱羧酶（Tyrosine decarboxylase,Tdc）和酪氨β-羟化酶（Tyramine beta-hydroxylase,Tβh）基因表达量无显著变化。进一步对血淋巴中章鱼胺信号通路相关代谢物质变化进行检测,结果发现,清除肠道微生物使橘小实蝇血淋巴中章鱼胺浓度显著下降28.33%,合成章鱼胺的前体物质酪胺浓度显著下降45.07%,合成章鱼胺的关键酶酪胺β-羟化酶浓度显著下降16.33%。这些结果表明清除肠道微生物显著影响CCH-2、CCH2R、Ast-A和OAR基因的表达及章鱼胺信号通路相关物质的浓度。为进一步研究肠道共生菌对神经肽基因表达的影响,我们对抗生素清除肠道微生物的试虫分别喂食回补以上6种肠道共生菌,并通过qPCR检测CCH-2、CCH2R、Ast-A及OAR 4种差异神经肽基因的表达量。结果表明,相比于抗生素清除肠道微生物组,回补6种肠道共生菌的试虫,CCH-2和CCH2R基因的表达量均未出现显著变化;回补K.michiganensis菌后Ast-A基因的表达量显著下调43.07%,恢复至正常水平,但回补其他共生菌对其表达量并无显著影响;清除肠道微生物后分别回补密歇根克雷伯氏菌K.michiganensis、霍氏肠杆菌E.horwaechei、阴沟肠杆菌E.cloacae、以及弗式柠檬酸杆菌C.freundii 4种共生菌后OAR基因的表达量显著均显著下调30.07%-50.62%,并恢复到正常水平,表明OAR基因的表达受多种共生菌的影响。由于K.michiganensis能显著影响Ast-A和OAR两种神经肽基因的表达及橘小实蝇的取食量,选取K.michiganensis进行后续研究,结果发现回补K.michiganensis后,相比于清除肠道微生物组,章鱼胺浓度显著上升30.24%,酪胺浓度显著上升34.39%,酪胺β-羟化酶浓度显著上升34.66%,均恢复到与对照组无差异的水平。以上研究结果表明肠道微生物K.michiganensis影响Ast-A基因和章鱼胺受体OAR基因的表达及章鱼胺信号通路相关代谢物质的合成。3.肠道共生菌通过Ast-A基因调控橘小实蝇的取食量由于肠道共生菌能影响橘小实蝇的取食量和神经肽Ast-A基因的表达,我们进一步研究肠道共生菌、Ast-A基因及宿主取食量三者之间的关系。结果表明:在正常橘小实蝇种群中,利用RNAi技术敲降Ast-A基因处理2d后,相对对照组,Ast-A基因表达量显著下调27.52%,取食量显著增加21.30%,结果说明Ast-A基因对橘小实蝇的取食具有抑制作用。进一步检测Ast-A RNAi后脂类和糖类物质的变化。结果表明,Ast-A RNAi 2d后,虫体内甘油三酯、葡萄糖和海藻糖含量分别显著上升144.47%、54.32%和63.35%。另一方面,相对正常种群,清除肠道微生物橘小实蝇Ast-A基因表达量显著上调15.90%,取食量显著下降31.13%。为进一步研究肠道微生物是否通过影响Ast-A基因的表达调控宿主的取食量,我们在清除肠道微生物种群中进行了Ast-A RNAi。结果表明,清除肠道微生物种群中Ast-A基因RNAi后,相比于ds-Egfp对照组,ds-Ast-A组基因表达量显著下降25.27%,恢复至正常种群水平,而取食量显著增加39.16%,也恢复到正常种群水平。这些结果表明清除肠道微生物造成的Ast-A基因表达上调被RNAi敲降、恢复到正常种群表达水平后,橘小实蝇取食量并不会因为清除肠道微生物而降低,与正常种群也无显著差别,因此肠道微生物的缺失会引起宿主Ast-A基因上调表达,进而导致宿主橘小实蝇取食量下降,即肠道微生物通过影响宿主橘小实蝇Ast-A基因表达,调控宿主的取食量。取食状态对生殖至关重要,因此我们进一步研究Ast-A基因对生殖的影响。结果表明,在正常的全营养饲喂情况下,Ast-A基因敲降对卵巢发育与繁殖力、存活率和饥饿抵抗力都无显著影响。但在半氮源饲喂情况下,由于营养缺乏,相比于正常饲喂组,橘小实蝇卵巢发育迟缓,总产卵量显著下降64.43%,单日产卵量在16 d、18 d和20 d时均有显著下降;但通过RNAi敲降其Ast-A基因后,卵巢发育得到改善,总产卵量显著提高1.13倍,单日产卵量在16 d和18 d时均有显著增加,均恢复到全营养饲喂种群水平。由此表明在营养缺乏情况下,Ast-A基因敲降可能通过促进橘小实蝇取食量,来维持其正常卵巢发育和繁殖力。综上所述,我们初步得出结论:橘小实蝇体内存在“肠道共生菌—神经肽—取食”调控通路,即肠道共生菌通过影响神经肽Ast-A基因的表达调控宿主的取食量。