目的:　　 Ⅵ型分泌系统是革兰氏阴性菌中新近发现的重要的分泌系统之一。虽然伤寒沙门菌具有完整的编码Ⅵ型分泌系统的基因簇,但目前尚缺乏伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统是否具有功能的实验证据支持。本文主要对伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统进行鉴定,在此基础上对伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统的功能及相关基因的表达调控进行初步探讨。　　 方法:　　 (1)SPI-6基因序列比对:本室测序获得伤寒沙门菌GIFU10007菌株的SPI-6基因序列,从Genebank中获取鼠伤寒沙门菌LT2菌株、伤寒沙门菌Ty2标准菌株及伤寒沙门菌CT18耐药菌株的SPI-6基因序列,利用NCBI上的Blast工具进行比对分析。　　 (2)构建pBAD-SciK-his6表达载体:根据sciK基因两端序列设计引物,以伤寒沙门菌GIFU10007基因组为模板,通过PCR获得该基因片段,与表达载体pBAD／gⅢ连接后,重组体转化至大肠杆菌DH5α。　　 (3)采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌sciS,sciC,sciG,vrgS缺陷变异株:根据伤寒沙门菌目标敲除基因序列设计引物,扩增目标敲除基因上、下游同源性片段,定向连接成目标敲除基因缺损型同源核苷酸片段,与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株,在5％蔗糖LB平板上进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为目标敲除基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。　　 (4)Western免疫印迹分析分泌蛋白和菌体蛋白:pBAD-SciK-his6质粒通过电击法转入伤寒沙门菌野生株和sciS,sciC,sciG,vrgS缺陷株,用L-阿拉伯糖诱导sciK基因表达后,利用三氯醋酸-丙酮法提取培养上清中的分泌蛋白,以抗His tag小鼠单克隆抗体进行Western免疫印迹分析分泌蛋白和菌体蛋白。　　 (5)以伤寒沙门菌sciG缺陷株作为Ⅵ型分泌系统功能缺陷株与野生株进行比较,在等渗条件下绘制生长曲线、半固体平板培养观察动力并且以HeLa细胞作为人上皮细胞模型进行侵袭实验。　　 (6)荧光定量RT-PCR:通过实时荧光定量RT-PCR观察sciS,sctC,sciG,vrgS和sciK基因在野生株和rcsB,pmrA,hfq,phoP基因缺陷株中转录水平的表达情况。　　 结果:　　 (1)伤寒沙门菌GIFU10007菌株具有完整的SPI-6基因序列,其SPI-6基因结构与伤寒沙门菌CT18菌株几乎完全相同。　　 (2)经PCR及序列分析验证,pBAD-SciK-his6表达载体构建成功。　　 (3)经PCR及序列分析验证,伤寒沙门菌sciS,sciC,sciG,vrgS缺陷变异株制备成功。　　 (3)经PCR验证,pBAD-SciK-his6质粒成功转化伤寒沙门菌野生株和sciS,sciC,sciG,vrgS缺陷株。Western免疫印迹分析在伤寒沙门菌野生株的分泌蛋白和菌体蛋白中均检测到SciK蛋白,但在以上各缺陷株中仅在菌体蛋白中检测到SciK蛋白,而在分泌蛋白中未检测到SciK蛋白。　　 (5)sciG基因缺陷变异株与野生株生存情况、动力无明显差异,sciG基因缺陷变异株侵袭上皮细胞能力较野生株增强。　　 (6)qRT-PCR结果显示,sciS,sciC,sciG,vrgS和sciK基因在伤寒沙门菌野生株与rcsB,pmrA,hfq,phoP基因缺陷株中的表达情况相似。与野生株相比,除了sciC外,sciS,sciG,vrgS和sciK的表达在pmrA基因缺陷株均明显下调。尽管sciS和sciG的表达在rcsB基因缺陷株中相比野生株明显下调,其他三个基因的表达没有明显差异。hfq基因缺陷株中只有sciK的表达与野生株相比明显下调,sciS,sciC,sciG,vrgS的表达与野生株相似。　　 结论:　　 伤寒沙门菌具有功能性的Ⅵ型分泌系统。SciS,SciC,SciG和VrgS为伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统的重要组成成分。伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统功可影响细菌对人上皮细胞的侵袭能力,但在等渗条件下对细菌的生长和动力不发挥作用。RcsB,PmrA和Hfq对伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统具有调控作用,但PhoP对伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统的调控没有影响。