【摘 要】
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目的:本研究是通过检测自噬及通路相关蛋白和基因的表达水平,探讨胃宁颗粒对胃癌细胞自噬的影响,从而解释胃宁颗粒对胃癌治疗的作用机制。为今后临床使用胃宁颗粒治理胃癌提供实验依据。方法:1、制备含药血清:将26只雄性SPF级大鼠分成生理盐水组、胃宁颗粒组、西药组。生理盐水组大鼠给予生理盐水灌胃10ml/kg/d。中药组大鼠给予胃宁颗粒灌胃18.38g/kg/d。西药组大鼠进行腹腔注射5-氟尿嘧啶（9.0
【基金项目】
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广西自然科学基金项目（编号:2018JJA140950）；
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目的:本研究是通过检测自噬及通路相关蛋白和基因的表达水平,探讨胃宁颗粒对胃癌细胞自噬的影响,从而解释胃宁颗粒对胃癌治疗的作用机制。为今后临床使用胃宁颗粒治理胃癌提供实验依据。方法:1、制备含药血清:将26只雄性SPF级大鼠分成生理盐水组、胃宁颗粒组、西药组。生理盐水组大鼠给予生理盐水灌胃10ml/kg/d。中药组大鼠给予胃宁颗粒灌胃18.38g/kg/d。西药组大鼠进行腹腔注射5-氟尿嘧啶（9.0g/L氯化钠注射液稀释）,每只鼠用药20mg/kg。连续给药7天后,行腹主动脉取血、离心、灭活以备后用。2、细胞干预培养:人胃癌SGC-7901和MKN-45细胞用胎牛血清加1640基础培养基培养至对数生长期后,将其分成空白组、生理盐水组、胃宁颗粒组和西药组。其中空白组用胎牛血清培养,其余三组加入相应含药血清。通过细胞增殖实验（CCK-8）,将各组含药血清按10%、15%、20%三种含药血清浓度干预细胞,分别干预12h、24h、48h,寻找药物干预细胞的最佳有效浓度和时间;利用显微镜观察药物干预后细胞形态的变化,以及对MDC染色后胃癌细胞绿色荧光的观察,分析各组间自噬体的形成和平均荧光强度的对比情况;通过蛋白免疫印迹法,检测含药血清干预后各组细胞内自噬相关蛋白LC3和p62的表达水平,同时检测各组细胞中AMPK/m TOR通路相关蛋白AMPK、m TOR及其磷酸化蛋白p-AMPK、p-m TOR的变化;用实时荧光定量聚合酶链反应技术,检测含药血清对SGC-7901和MKN-45细胞中LC3、p62、AMPK和m TOR m RNA表达的影响。结果:1、CCK-8增殖实验结果显示,与生理盐水组相比,胃宁颗粒组能显著抑制胃癌细胞增殖,其抑制作用呈现剂量依赖性,与作用时间无关,含药血清最佳干预浓度为20%,最佳干预时间为24h（P＜0.01）。2、经过20%浓度含药血清干预24h后,通过显微镜观察可发现,两株细胞的空白组和生理盐水组细胞贴壁状态良好,细胞轮廓清晰,排列紧密;而胃宁颗粒组和西药组细胞形态均发生变化,细胞状态差,密度小。3、MDC染色结果显示,两株胃癌细胞空白组和生理盐水组细胞自噬水平低,胞质呈均匀的浅绿色,而胃宁颗粒组和西药组出现强荧光信号;通过计算平均荧光强度,在两株胃癌细胞中,与生理盐水组相比,胃宁颗粒组与西药组有更强的荧光强度（P＜0.01）;而在SGC-7901细胞中,胃宁颗粒组的平均荧光强度水平远高于西药组（P＜0.01）。4、蛋白免疫印迹实验表明,胃宁颗粒能促进胃癌细胞中LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的转化,下调p62的蛋白表达;提高AMPK蛋白表达,p-AMPK/AMPK的比值升高,下调mTOR蛋白水平,p-mTOR/m TOR比值降低（P＜0.05）。5、实时荧光定量聚合酶链反应结果显示,与生理盐水组相比,胃宁颗粒组细胞中LC3 mRNA水平显著提高,p62 mRNA水平显著降低（P＜0.01）。与生理盐水组相比,胃宁颗粒组和西药组AMPK m RNA表达提高,m TOR m RNA表达下调（P＜0.05）。结论:1、胃宁颗粒能提高胃癌细胞中LC3蛋白和基因的表达水平,下调p62蛋白和基因的表达,对胃癌细胞有显著的自噬诱导现象。2、胃宁颗粒能上调胃癌细胞中AMPK磷酸化水平,抑制m TOR蛋白活化,其诱导自噬发生的机制可能与AMPK/mTOR通路有关。
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