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花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）为芸香科花椒属植物,具有很高的食用及药用价值。麻味素是花椒中产生风味和药用活性的特有成分,现已分离出27种,均为不饱和脂肪酸酰胺类物质。目前对这类化合物在花椒中合成调控和次生代谢途径的研究较少,仅有文献报道麻味素可能由氨基酸脱羧后的产物和不饱和脂肪酸两部分结合组成,但具体的合成通路至今尚未阐释清楚。课题组前期对麻味素积累差异大的三个花椒品种进行了转录组测序,筛选出19个与不饱和脂肪酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸生物合成相关的差异基因。本研究在此基础上针对不饱和脂肪酸合成过程中的两个关键基因（c99494 graph＿c0和c102796 graph＿c0）进行了功能的初步验证,旨在为麻味素合成通路的进一步阐明提供理论依据。主要结果如下:1. 对转录组获得的目的基因c99494 graph＿c0和c102796 graph＿c0全长c DNA序列进行生物信息学分析,同源序列比对表明,其属于不饱和脂肪酸脱氢酶并预测两个目的基因分别为Zb FAD2和Zb FAD3。通过ORF Finder分析确定两个目的基因的读码框长度分别为1152bp和1167bp。对Zb FAD2和Zb FAD3序列所编码的氨基酸序列和其他10种植物的氨基酸序列构建进化树,结果表明花椒与柑橘属最先归为一类,亲缘关系较近,而与栎属以及黄麻属的亲缘关系较远。通过氨基酸序列分析预测了蛋白性质与结构,其中Zb FAD2预测蛋白质共有383个氨基酸,分子量为44.16k Da,等电点为8.04,亲水总平均值（GRAVY）为-0.013,不稳定指数为37.48;Zb FAD3预测蛋白质共有388个氨基酸,分子量为44.79k Da,等电点为8.76,亲水性总平均值为-0.116,不稳定指数为33.76。2. 成功构建了T7-pET30a-Zb FAD2和T7-pET30a-Zb FAD3原核表达载体,并用其转化E.coli BL21表达菌株。IPTG诱导目的基因Zb FAD2与Zb FAD3表达,并纯化得到两个重组蛋白。通过SDS-PAGE检测发现得到的两个蛋白大小均在44k Da左右,此结果与预测大小相符。利用气相色谱检测技术,对蛋白酶进行底物反应及产物鉴定,发现重组蛋白Zb FAD2可以和底物油酸（C18:1△9）反应生成了亚油酸(C18:2△9,12),Zb FAD3可以和底物亚油酸反应生成α-亚麻酸(C18:3△9,12,15),此结果证明目的基因与其同源序列的功能相同即分别在脂肪酸链中引入第二个双键和在脂肪酸链中引入第三个双键的过程中起到催化作用。3. 成功构建了35S-pCAMBIA2300-Zb FAD2与35S-pCAMBIA2300-Zb FAD3植物过表达载体,并通过农杆菌介导法分别将其转化至烟草和拟南芥。通过气相色谱测定转基因拟南芥中脂肪酸的含量,发现Zb FAD2转基因型拟南芥种子与野生型相比油酸含量降低,亚油酸含量升高,而在Zb FAD3转基因型拟南芥中亚油酸含量降低,亚麻酸含量升高,再次验证了Zb FAD2可以催化油酸反应生成亚油酸,Zb FAD3可以催化亚油酸反应生成α-亚麻酸。利用高效液相色谱法测定转基因烟草中麻味素的含量,Zb FAD2转基因型烟草叶片中羟基-α-山椒素含量（0.2167±0.0026 mg/g）明显高于野生型（0.0875±0.0049mg/g）,而在Zb FAD3转基因型烟草叶片中羟基-α-山椒素含量（0.0535±0.0037mg/g）则明显低于野生型,验证了这两个目的基因在麻味素合成通路中具有一定的作用,且不饱和脂肪酸合成与麻味素的合成相关。