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背景:乳腺癌已成为全球最常见的癌症,其中三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是恶性程度最高的一种分型。由于TNBC缺少常用激素治疗的靶标,且具有异质性高、易转移、易耐药等特点,急需寻找明确有效的靶向治疗方法。天然化合物一直是抗癌小分子药物的重要来源,抗霉素（Antimycin）家族是由放线菌中分离得到的一类重要天然小分子化合物,近年来越来越多的研究开始关注它的抗肿瘤效果。研究发现Antimycin类化合物可以通过多种方式产生抗肿瘤活性,但目前缺少其对三阴性乳腺癌的作用效果及作用机制研究。有研究表明含3-甲酰基水杨酸基团的Antimycin类化合物可能通过抑制K-Ras膜定位而发挥抗肿瘤活性。Ras蛋白在维持细胞正常生长增殖等重要生理功能中起重要作用,Ras异常高表达可显著提升TNBC的耐药性,最常发生突变的Ras是K-Ras亚型。本实验室前期实验中筛选出三种抗霉素化合物,分别命名为Antimycin-1、Antimycin-2、Antimycin-3,它们均特异性的显著抑制三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-453）活力,其中尤以含3-甲酰基水杨酸基团的Antimycin-1的抑制作用最强,但具体药物作用机制仍需进一步探究。目的:本课题旨在明确前期实验中筛选得到的三种Antimycin类化合物对TNBC细胞的特异性杀伤作用,分析抑制作用最强的Antimycin-1对TNBC细胞功能的影响,并探索Antimycin-1抑制TNBC细胞的作用机制及其动物安全性。方法:1、通过CCK8检测三种Antimycin类药物对多种肿瘤细胞的抑制效果,观察药物对细胞形态和细胞骨架的影响,通过克隆形成实验检测和划痕实验分别检测低浓度的Antimycin-1对三阴性乳腺癌细胞克隆生成能力及迁移能力的影响。2、通过流式细胞术检测Antimycin-1处理三种三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453）和正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）后,各细胞凋亡或坏死的比例及细胞周期时相的变化,通过q PCR检测细胞周期相关关键蛋白的基因水平变化。3、用20 nmol·L-1的Antimycin-1处理三种三阴性乳腺癌细胞后,使用流式细胞术检测细胞ROS水平的变化,使用免疫荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位水平变化,并通过激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化及DNA损伤情况。4、通过蛋白质免疫印迹实验检测Antimycin-1处理三阴性乳腺癌细胞后,细胞中Akt、Mek、Erk总蛋白及其相应蛋白磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达水平的变化。5、构建稳定表达外源e GFP-KRas蛋白的三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞株,观察Antimycin-1处理后K-Ras定位变化。6、给昆明小鼠隔日腹腔注射不同剂量的Antimycin-1,观察小鼠存活情况。分别使用Antimycin-1进行高剂量单次和低剂量多次的方式处理小鼠,取心、肝、脾、肺、肾组织并进行H&E染色,观察小鼠重要脏器损伤情况。7、所有实验重复三次,用Graph Prism8统计软件分析数据,使用Student’s t检验分析两组间差异,使用One-way ANOVA分析多组间差异,P<0.05时差异具有统计学意义。结果:1、Antimycin类药物特异性抑制三阴性乳腺癌细胞的活力:三种Antimycin类药物均特异性的显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖,其中Antimycin-1的抑制效果最强,对三种三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的IC50（半数抑制浓度）均达到纳摩尔级别。Antimycin-1处理细胞后,对照细胞形态无明显改变,但三阴性乳腺癌细胞显著皱缩,细胞骨架也遭到明显破坏。同时,5 nmol·L-1的Antimycin-1即可显著抑制三阴性乳腺癌细胞的克隆生长能力与迁移能力。2、Antimycin-1影响三阴性乳腺癌细胞多种细胞功能:纳摩尔级浓度的Antimycin-1即可在短时间内引起三阴性乳腺癌细胞大量死亡,但对其细胞周期的影响不大。20 nmol·L-1的Antimycin-1处理4 h内,三阴性乳腺癌细胞已经出现明显的DNA损伤。同时Antimycin-1处理三阴性乳腺癌细胞24 h内其ROS水平保持不变或略有下降,处理20 h后线粒体膜电位才开始下降。3、Antimycin-1抑制三阴性乳腺癌细胞中K-Ras膜定位并降低K-Ras信号下游关键蛋白的磷酸化水平:20 nmol·L-1的Antimycin-1处理5 h内即可显著降低三阴性乳腺癌中K-Ras下游Akt、Mek、Erk蛋白的磷酸化水平。正常情况下K-Ras稳定分布于细胞膜上,但20 nmol·L-1的Antimycin-1处理MDA-MB-468细胞1 h后K-Ras膜定位受到抑制,出现明显的胞内聚集现象。另外发现Antimycin-1处理不影响三阴性乳腺癌细胞凋亡相关蛋白的表达。4、动物实验中Antimycin-1应选择低剂量间隔给药的给药方式:小鼠亚急性毒性实验结果显示,Antimycin-1安全剂量相对较低。急性损伤组心、肝、脾、肺和肾等多脏器出现严重充血,而慢性损伤组脏器损伤相对较轻。为减少Antimycin-1的毒副作用,进行后续动物实验时应选择0.2 mg·kg-1以下的剂量间隔给药。结论:本研究首次发现Antimycin-1通过抑制K-Ras膜定位、降低K-Ras下游关键蛋白的磷酸化水平而特异性抑制三阴性乳腺癌细胞多种细胞功能,最终诱导细胞死亡的作用机制。另外研究发现Antimycin-1进行动物实验时应选择0.2 mg·kg-1以下的剂量间隔给药。本研究为进一步探究Antimycin类药物作用机制及三阴性乳腺癌新治疗靶点提供了新的理论依据.