研究背景角膜具有透明、无血管、有弹性的特点和较强的屈光能力。正常角膜组织分为上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层；其中上皮层由多层上皮细胞组成,基质层含有角膜细胞,内皮层由单层排列内皮细胞构成。角膜缘含有丰富的血管网,主要供给角膜周边部的养分；房水、泪液等也是养分的重要来源。在炎症、外伤、免疫损害、微生物感染等病理因素作用下,角膜缘周边血管网逐渐长入透明角膜内,形成角膜新生血管。角膜新生血管在抵御病理损害中具有重要作用,可以促进炎症吸收、角膜修复并改善角膜血供；同时由于大量的免疫效应细胞聚集在角膜,改变了角膜固有的免疫学特征,导致角膜相对免疫赦免机制的消除；降低角膜的透明性,严重影响视力；为角膜疾病的后续治疗带来重大挑战。深入研究角膜新生血管生长和调控的机制具有重要的意义。研究发现角膜新生血管的影响因素有很多,炎症反应是角膜新生血管的重要影响因素之一。角膜新生血管与炎症反应相互作用、相互依赖、相互协同。角膜炎性细胞浸润通常出现在新生血管之前,角膜炎性浸润部位与新生血管部位一致。炎症反应引起多种炎性介质、细胞因子释放,从而打破促血管生长因子和抑制血管生长因子之间的平衡,最终导致角膜新生血管。信号转导研究是生命科学的热点和前沿,其基本研究思路已浸染生命科学的各领域。信号转导将为解释生命基本现象、细胞代谢、肿瘤分子机制、病理反应过程以及开发新型药物提供新的思路。丝裂原活化蛋白激酶是一组能被不同细胞外刺激激活的一系列丝氨酸-苏氨酸激酶,可磷酸化其它细胞质蛋白,并从细胞浆移位至细胞核,作用于多种转录因子,从而激活不同基因表达,产生复杂的生物学功能。在哺乳动物,高度保守的丝裂原活化蛋白激酶是信号从细胞外到细胞核传递的重要信使,参与了胚胎发育、细胞分化、细胞增殖、细胞死亡、对环境的应激适应、炎症反应等多种细胞生理及病理反应。目前共发现了四种丝裂原活化蛋白激酶亚族,分别是细胞外信号调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38和ERK5。细胞外信号调节蛋白激酶主要作用于细胞分化、转化和增殖；c-Jun氨基末端激酶参与胚胎发育、细胞分化,并且与肿瘤的发生密切相关：ERK5信号通路参与细胞周期、细胞增殖和早期基因表达的调控；而p38信号通路则在炎症反应中具有重要作用。p38信号通路的激活是细胞内磷酸化级联反应的最后步骤,磷酸化p38是p38的活化形式。p38激活后立即进入细胞核,激活多种蛋白激酶和转录因子,产生复杂的生物学效应。p38在炎症反应过程中的多效性、高效性,使得p38信号转导通路成为炎症相关疾病研究的新的作用靶点而备受关注。p38成为丝裂原活化蛋白激酶家族中调控炎症反应的最重要成员。炎症反应与角膜新生血管密切相关,而p38信号转导通路在调控炎症反应中具有重要作用,因此p38信号转导通路可能在角膜新生血管调控中具有重要作用。研究也发现p38抑制剂在炎症相关疾病动物模型中表现出较好的抗炎作用,p38信号转导通路抑制剂SB220025能显著降低肉芽肿组织内血管密度。角膜新生血管研究一直是眼科研究的热点和难点。p38信号通路具有复杂的生物学效应,参与炎症反应过程,调控多种细胞因子的表达,从该通路研究角膜新生血管的机制,必将成为研究的新方向和新靶点。实验中,我们通过检测血管化进程中大鼠角膜磷酸化p38表达,来探讨p38信号转导通路和角膜新生血管的相关性；通过研究p38信号转导通路特异性拮抗剂SB203580对大鼠角膜的毒性作用,来研究其用于阻断信号转导通路的可能性；进一步研究SB203580对大鼠角膜新生血管的抑制作用,探讨p38信号转导通路参与调控角膜新生血管的可能机制；最后通过可溶性血管内皮生长因子受体2试图阻断血管内皮生长因子的作用,进一步检测磷酸化p38的表达,并分析p38信号转导通路和血管内皮生长因子的关系。第一部分磷酸化p38在大鼠角膜血管化进程中的表达目的检测p38和磷酸化p38在大鼠角膜血管化进程中的表达,探讨大鼠角膜新生血管生长是否和p38信号转导通路的激活相关,并进一步分析p38和磷酸化p38在大鼠角膜血管化进程中时间和空间分布特征,拟最终证实p38信号转导通路激活可能与大鼠角膜新生血管相关,p38信号转导通路的早期激活可能是大鼠角膜新生血管的始动因素之一,为进一步研究奠定基础。方法1.角膜缝线法建立SD大鼠角膜新生血管模型建立大鼠右眼新生血管模型,在大鼠角膜缘内1mm等间距缝合3针,深及基质层。选取未缝线的正常角膜作为阴性对照组,并将缝线后大鼠随机分为缝线后第1日组,第3日组以及第7日组,每组8只。2.显微镜下观察角膜缝线后每日在手术显微镜下观察,均放大16倍,注意角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染。3.计算角膜新生血管面积计算角膜缝线后第1日、第3日以及第7日,分别在显微镜下测量角膜新生血管长度,并依据Robert公式计算角膜新生血管面积。4. Western Blot检测缝线后角膜血管化进程中p38和磷酸化p38的表达缝线当日以及缝线后第1、3、7日,分别从各组随机选取5只大鼠,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Blot方法检测各组角膜p38以及磷酸化p38的表达,并检测目的蛋白IOD与内参GAPDH的IOD,二者比值作为目的蛋白的相对表达量。5.免疫荧光检测p38和磷酸化p38在角膜上的表达按照分组分别在特定时间摘取角膜,采用免疫荧光的方法检测p38和磷酸化p38在角膜的表达以及定位。6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示。当方差齐性时,采用one-way ANOVA分析；方差不齐时采用Welch法校正。组间比较,当方差齐性时,采用LSD分析；当方差不齐性时,采用Dunnett T3进行分析。所有统计推断均采用双侧检验,检验水准α=0.05。结果1.显微镜下观察缝线后7d,角膜缘血管网充血,缝线处角膜水肿增厚,并随时间延长逐渐加重,缝线后3d,睫状充血明显,角膜缝线处角膜缘明显局限性充血,可见新生血管缓慢长入,每处约2-5支,缝线处角膜未见明显混浊,全角膜透明；缝线后7d,见大量新生血管长入透明角膜,新生血管呈密集网状,无法计数,部分新生血管长到缝线处,缝线处角膜轻度混浊并增厚。2.角膜新生血管面积缝线后第1日,未发现新生血管；缝线后3、7d,角膜新生血管面积分别为4.1-1.22、7.26±0.72mm2；而正常角膜无新生血管。3.Western Blot结果各组角膜p38的相对表达量为：正常角膜组0.5681±0.1074,缝线后第1日组为0.5512±0.0795,第3日组为0.5517±0.0908,第7日组为0.5641±0.1168；不同实验组间p38的表达量无显著性差异(F=0.037,P=0.990)。各组角膜磷酸化p38的相对表达量为：正常角膜组0.2969±0.0475,缝线后第1日组0.6219±0.0609,第3日组0.2812±0.0602,第7日组为0.3149±0.0496；不同组之间磷酸化p38相对表达量有显著性差异(F=43.895,P=0.000)；以缝线后第1日最高,缝线后第3、7日次之；而正常角膜与缝线后第3、7日无显著性差异。4.免疫荧光结果各组p38表达基本一致,主要分布在炎性浸润细胞,新生血管内皮细胞以及部分上皮细胞,主要定位于细胞浆；而磷酸化p38表达在炎性细胞、新生血管内皮细胞,主要定位于细胞核,在缝线后第1日高表达。结论1.在大鼠角膜血管化进程中,p38表达基本恒定；而磷酸化p38在缝线后第1日,即出现高峰表达,而后迅速衰减,至缝线后第3、7日已基本恢复至正常。2.大鼠角膜缝线后,早期即有p38信号通路的强激活,而后逐渐出现可观察到的角膜新生血管。3.缝线后大鼠角膜新生血管化可能与p38信号传导通路激活相关。4.p38信号传导通路的早期激活可能是缝线后角膜新生血管生长的始动因素之一。第二部分结膜下注射50μmol/L p38信号传导通路抑制剂SB203580对大鼠角膜的毒性作用目的研究结膜下注射SB203580对大鼠角膜的毒性作用,探索结膜下注射SB203580的合适浓度,探讨结膜下注射SB203580用于阻断p38信号传导通路的可能性,为后续实验奠定基础。方法1.配置50μmol/L SB203580溶液取0.05mL预冷的二甲基亚砜加入1mgSB203580中,振荡,然后加入预冷的生理盐水53.00mL,充分振荡混匀。按每支1mL分装于无菌冻存管中,-20℃冻存备用。2.实验分组SD大鼠适应性饲养1周,裂隙灯显微镜检查排除大鼠结膜、角膜疾病后,随机分为50μmol/L SB203580组和生理盐水组,每组10只。3.结膜下注射均选右眼进行实验,在角膜缘外0.5～1.0mm,沿顺时针方向,在12,2,4,6,8,10,12点位注射,依次每日选取1个注射点,每日1次行结膜下注射,共7d。按照实验分组分别注射50μmol/L SB203580和生理盐水0.04mL。4.实验观察以及角膜炎症指数评分在裂隙灯显微镜下观察注射点结膜充血情况、角膜透明情况以及上皮是否完整等。结膜下注射7d后,在裂隙灯下观察中央角膜水肿程度、周边角膜水肿程度以及睫状充血程度行角膜炎症指数评分。5.组织学及透射电镜观察结膜下注射7d后,摘取角膜,沿中心线剖切一分为二。一半用40g/L多聚甲醛固定,常规制作石蜡切片,苏木精-伊红染色观察组织学改变；另一半迅速用预冷的25g/L戊二醛固定,常规丙酮梯度脱水、渗透、包埋,超薄切片,醋酸铀及柠檬酸铅双重染色,透射电镜观察。6.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用T检验,所有统计推断均采用双侧检验,检验水准a=0.05。结果1.动物观察裂隙灯显微镜下观察发现SB203580注射部位结膜呈可逆性贫血状改变,注射次日即消失；在注射过程中,连续观察见角膜始终透明,上皮层无水肿、无剥脱。2.在连续结膜下注射SB203580或生理盐水7d后,两组大鼠角膜炎症指数分别为：0.14±0.07,0.21±0.10,两组间炎症指数无显著性差异(t=1.716,P=0.103)；其中两组睫状充血程度评分分别为：0.70±0.48和1.30±0.67,生理盐水组睫状充血程度评分显著高于SB203580组(t=2.286,P=0.035)。3.组织学检查发现所有大鼠角膜上皮层完整,基质层排列规则,内皮层连续、无断裂。进一步透射电镜观察,细胞结构及细胞器未见明显异常。结论1.连续7d结膜下注射50μmol/L SB203580对大鼠角膜无明显毒性作用,未发现角膜组织结构以及超微结构的典型损害。2.连续结膜下注射50μmol/L SB203580组大鼠睫状充血程度评分显著低于连续结膜下注射生理盐水组,推测可能与SB203580的抗炎症反应有关。第三部分结膜下注射50μmol/L SB203580抑制大鼠角膜新生血管的实验研究目的研究结膜下注射50μmol/L SB203580对大鼠角膜新生血管的抑制作用,检测其对大鼠角膜磷酸化p38和血管内皮生长因子A表达的影响,并分析大鼠角膜的组织结构特征,初步探讨结膜下注射50μmol/L SB203580抑制大鼠角膜新生血管的可能机制。方法1.角膜缝线法建立SD大鼠角膜新生血管模型采用缝线法建立SD大鼠右眼角膜新生血管模型,将缝线后的大鼠随机分为两组：50μmol/L SB203580结膜下注射组和生理盐水结膜下注射组,每组8只。2.结膜下注射依据分组从术后第1日开始用药,分别结膜下注射不同药物,每日1次,共7d。3.临床观察角膜缝线后每日在手术显微镜下观察,均放大16倍,注意角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染。4.计算角膜新生血管面积计算角膜缝线后第7日,分别在显微镜下测量角膜新生血管长度,并依据Robert公式计算角膜新生血管面积。5.Western Blot检测磷酸化p38和血管内皮生长因子A的表达缝线后第7日,分别从各组随机选取5只大鼠,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Blot方法检测各组角膜磷酸化p38和血管内皮生长因子A的表达。6.免疫组织化学法染色检测CD31的表达和常规病理学检查缝线后第7日,摘取角膜,常规多聚甲醛固定,连续切片,常规苏木精-伊红染色观察组织学改变,并行免疫组织化学染色检测CD31的表达。7.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,所有统计推断均采用双侧检验,检验水准a=0.05。结果1.显微镜下观察生理盐水组大鼠角膜缝线后1d,角膜缘血管网充血；缝线后3d,睫状充血明显,缝线处新生血管缓慢长入,角膜透明；缝线后7d,见大量新生血管长入透明角膜,新生血管呈密集网状。而50μmol/L SB203580组大鼠角膜缝线后1d,角膜缘血管网充血不明显；缝线后3d,纤细血管开始长入透明血管；缝线后7d,见细小血管逐渐长入,均未到达角膜缝线处。2.缝线后7d两组角膜新生血管面积比较50μmol/L SB203580结膜下注射组和生理盐水结膜下注射组的角膜新生血管面积分别为4.78±1.25和6.86±1.25mm2; SB203580组角膜新生血管面积低于生理盐水组(t=-3.319,P=0.005)。结膜下50μmol/L SB203580抑制大鼠角膜新生血管生长。3. Western Blot结果缝线后7d,50μmol/L SB203580结膜下注射组和生理盐水结膜下注射组大鼠角膜磷酸化p38的相对表达量分别为0.2603±0.0396和0.3937±0.1039,磷酸化p38在SB203580组的表达显著低于生理盐水组(t=-2.682,P=0.028)；血管内皮生长因子A在两组的相对表达量分别为0.6904±0.1032和0.7411±0.1007,两组血管内皮生长因子A的表达量无显著性差异(t=-0.786,P=0.454)。结膜下注射50μmol/L SB203580能抑制磷酸化p38表达；而对血管内皮生长因子A的表达无明显影响。4.病理学及免疫组织化学染色结果术后7d,50μmol/L SB203580组角膜各层排列整齐,新生血管管腔细小、密度低,炎性细胞浸润少, CD31染色结果：强表达于新生血管管腔内皮细胞,排列尚规整,角膜内皮细胞弱表达；而生理盐水组角膜大量血管样结构,管腔较大、较多,炎性细胞浸润多且分布无规则,进一步CD31染色：大量阳性细胞分布于新生血管,排列杂乱,部分炎性浸润细胞亦有较强表达。结论1.结膜下注射50μmol/L SB203580显著抑制大鼠角膜新生血管生长。2.结膜下注射50μmol/L SB203580抑制磷酸化p38的表达,即抑制p38的激活；而对大鼠角膜VEGFA的表达无显著影响。3.SB203580抑制炎症反应,抑制炎性细胞在角膜的浸润。4.进一步证实p38信号转导通路和大鼠角膜新生血管调控相关。5.靶向p38阻断可能是角膜新生血管治疗的新策略。第四部分可溶性血管内皮生长因子受体2对血管化大鼠角膜磷酸化p38表达的影响目的采用可溶性血管内皮生长因子受体2阻断血管内皮生长因子与其受体的结合,研究其是否能抑制大鼠角膜新生血管生长,并进一步探讨其是否参与p38信号转导通路的激活,最终分析p38信号转导通路参与调控角膜新生血管是否与血管内皮生长因子途径相关。方法1.建立大鼠角膜新生血管模型采用缝线法建立SD大鼠右眼角膜新生血管模型,将缝线后的大鼠随机分为两组：可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组和生理盐水结膜下注射组,每组8只。2.结膜下注射依据分组从术后第1日开始用药,分别结膜下注射不同药物,每日1次,共7d。3.临床观察每日在显微镜下观察角膜缝线后角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染,并重点观察角膜新生血管情况。4.计算后缝线后7d两组角膜新生血管面积显微镜下测量角膜新生血管的长度并计算角膜新生血管面积。5.Western Blot检测两组大鼠角膜p38和磷酸化p38的表达缝线后7d,各组分别随机选取5只,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Blot方法检测各组角膜p38和磷酸化p38的表达。6.病理学及免疫荧光检查各组随机选取3只角膜,常规多聚甲醛固定,行病理学检查；修复抗原后行免疫荧光检测p38和磷酸化p38的分布。7.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用T检验,所有统计推断均采用双侧检验,检验水准a=0.05。结果1.动物观察生理盐水对照组,在观察过程中,睫状充血明显,新生血管管腔较粗且生长较快,缝线后7日,大量密集网状新生血管跨越角膜缝线处。而可溶性血管内皮生长因子受体2组在观察2.角膜新生血管面积结果可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组和生理盐水注射组大鼠角膜新生血管面积分别为3.87±0.73和6.94±0.92mm2,可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组显著低于生理盐水结膜下注射组(t=-7.343,P=0.000)。3.Western Blot结果可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组和生理盐水组大鼠角膜p38的相对表达量分别为0.6179±0.1334和0.6038±0.1484,两组p38表达无显著性差异(t=0.158,P=0.878)；两组磷酸化p38的相对表达量分别为0.2667±0.0642和0.4771±0.1171,可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组显著低于生理盐水注射组(t=-3.523,P=0.008)。结膜下注射可溶性血管内皮生长因子受体2抑制p38激活。4.病理学和免疫荧光检查结果术后7d,可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组角膜各层排列整齐,新生血管管腔细小、密度低；而生理盐水组角膜见大量血管样结构,管腔较大、较多,炎性细胞浸润杂乱。两组p38免疫荧光检测分布基本一致,多位于细胞浆；而磷酸化p38强表达在生理盐水组,定位均在细胞核内。结论1.结膜下注射可溶性血管内皮生长因子受体2抑制大鼠角膜新生血管生长。2.结膜下注射可溶性血管内皮生长因子受体2抑制大鼠角膜血管化进程中p38信号转导通路的激活,下调磷酸化p38的表达。3.p38与血管内皮生长因子所介导的信号转导过程既互相联系、偶有协同,又相对独立、各自作用；在纷繁复杂的细胞信号转导网络中,二者可能不是简单的线性排列关系。