鳞状细胞癌是口腔颌面部恶性肿瘤中一种常见的病理类型,约占90%,而在口腔鳞癌中,最常见类型的其中之一就是舌鳞状细胞癌。治疗舌鳞状细胞癌,目前主要采取综合手术疗法、放射疗法、化学疗法及生物疗法等各种治疗方法的序列治疗方案,尽管取得一定的近期效果,但是远期治疗效果仍不是十分理想,因该方案并没有从根本上解决术后复发及癌瘤转移等临床肿瘤治疗中的主要难题。近年来,随着对肿瘤研究的不断深入,学者发现某些肿瘤细胞与干细胞具有相似的生长调控机制,肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)的理论随之诞生。该理论认为：肿瘤组织中存在少量干细胞样的癌细胞亚群,具有自我更新、多向分化及强增殖能力,能够分化为构成肿瘤的大部分细胞,并使肿瘤具有异质、增殖、浸润等特性,这一细胞亚群被称为：肿瘤干细胞。虽然它们只占肿瘤的一小部分,却是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。肿瘤干细胞理论的提出开启了肿瘤治疗领域的新纪元,突破了传统癌症治疗的本质观念。通过对其生物学特性的研究并建立相应的实验模型,寻找靶向肿瘤干细胞的抗癌策略,以根治肿瘤的复发和转移,成为研究的热点。其中,选择何种细胞表面标志物来证实肿瘤干细胞的存在并完成对肿瘤干细胞的提取和鉴别是首要亟待解决的问题。p75神经营养蛋白受体(p75neurotrophin receptor, p75NTR)是一种神经营养因子的低亲和力受体,分子量为75kDa。是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。在体内,p75NTR可通过不同的信号传导通路诱导细胞发生增殖、分化、迁移、凋亡等生物学行为。研究表明,其实现这一复杂生物学活性主要通过两种途径：①与Trks受体的相互调节作用；②参与促进细胞存活或凋亡的自主信号的启动及调控作用。近年来,研究发现p75NTR的表达与多种肿瘤的发生和发展相关,并已证实其在全身多种肿瘤中是可以作为一种肿瘤干细胞的表面标志物。鉴于此,本实验通过研究p75神经营养因子受体(p75NTR)在舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113及Cal-27中的表达,并采用流式细胞分选技术对舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113及Cal-27以p75NTR为标志进行分选,进一步对其分选得到的p75NTR阳性癌细胞进行生物学特性研究等,探讨p75N’TR作为肿瘤干细胞标志物和预测口腔鳞状细胞癌愈后指标的可能性,为深入研究舌鳞状细胞癌的发病机理和寻找新的治疗靶点提供线索。第一部分舌鳞癌细胞系单细胞体外增殖及p75NTR的表达目的：研究p75NTR在舌鳞癌细胞系中的表达,并观察舌鳞癌Cal-27细胞系的单细胞体外增殖能力,寻找肿瘤干细胞存在的依据,探寻以p75NTR作为舌鳞癌干细胞膜蛋白标志进行实验研究的可行性。方法：对舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113和Cal-27进行流式细胞检测,检测癌细胞中p75NTR的表达。并对Cal-27细胞进行体外单克隆培养,观察Cal-27的增殖、分裂特性。并应用SPSS13.0软件,采用X2检验进行分析。结果：p75NTR在舌鳞状细胞癌细胞系中有阳性表达,百分比大约为3.1%(Tca-8113)和1.9%(Cal-27)。体外单克隆八天后,Cal-27细胞中仍有继续增殖能力的细胞孔数占开始时细胞总量的13.8%；十二天后,这一比例降至4.4%；十六天后,仅有3.7%的细胞孔数继续分裂增殖。结论：舌鳞癌细胞系Cal-27具有异质性,只有微量细胞具有持续的分裂增殖能力,同时仅有极少量细胞呈p75NTR阳性表达,该结果提示p75NTR具有被作为肿瘤干细胞特异性表面标志物的可能性。但其在舌鳞状细胞癌的发病过程中所起的作用及机制,及其与舌鳞状细胞癌中肿瘤干细胞的确切关系仍有待于我们进一步的研究。第二部分p75NTR阳性舌鳞癌细胞的生物学特征性相关研究目的：通过对舌鳞癌细胞系流式细胞仪分选获得的p75NTR阳性细胞进行生物学特性研究,探寻p75NTR阳性细胞是否具有肿瘤干细胞的特性。方法：通过流式细胞仪分选获取p75NTR阳性舌鳞癌细胞,进行增殖能力、自我更新、多项分化能力和成瘤能力的检测：1.免疫细胞化学检测p75NTR阳性舌鳞癌细胞中CD44的表达；2.对p75NTR阳性和未分选舌鳞癌细胞进行单克隆培养,培养14天后比较其单克隆能力,收集p75NTR阳性舌鳞癌细胞形成单克隆的细胞正常培养两周,检测其p75NTR阳性比例；3.MTT实验比较p75NTR阳性和未分选的舌鳞癌细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线；4.划痕实验比较p75NTR阳性和未分选的舌鳞癌细胞迁移能力；5,体内成瘤实验对比p75NTR阳性和未分选的舌鳞癌细胞成瘤能力。结果：CD44在舌鳞癌细胞系Tca-8113和Cal-27的p75NTR阳性细胞中高表达,所占比例大约为50%。在舌鳞癌细胞系Tca-8113和Cal-27中p75NTR阳性细胞与未分选的对照组细胞相比,p75NTR阳性细胞的单克隆形成能力较同源的未分选的对照组细胞的单克隆形成能力相比均显著增高(P<0.01)；单克隆化后的p75NTR阳性细胞再培养两周后,检测到大量p75NTR阴性细胞,p75NTR+细胞的比例下降到14.5%和5.8%；MTT实验证明p75NTR阳性细胞生长均较迅速(P<0.01)；同时相对于未分选的细胞具有更强的迁移能力；p75NTR阳性细胞与未分选的对照组细胞相比,裸鼠体内致瘤能力无显著统计学意义,但p75NTR阳性细胞组成瘤速度快。结论：p75NTR阳性细胞具有较强的增殖能力、迁移能力、自我更新和分化能力以及较快的成瘤能力,且能够在产生的子代细胞中保持其细胞特性,并能分化产生其它表型的细胞(p75NTR阴性细胞)。说明p75NTR阳性舌鳞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。为进一步研究舌鳞癌干细胞提供了一种有效的方法和途径,也为我们进一步从肿瘤干细胞角度研究舌鳞状细胞癌的发病机理和寻找新的治疗靶点提供了线索。