论文部分内容阅读
研制开发有效的新型抗结核疫苗，是当前结核病研究的主要目标。树突状细胞（DC）表面具有高密度的抗原递呈分子和共刺激分子，能刺激初始型（na（?）ve）T细胞大量活化增殖。分枝杆菌Hsp65蛋白（热休克蛋白）作为免疫优势抗原，能诱导和增强机体的抗结核免疫应答。我们用含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的质粒pEGFP-C1作为载体，用结核杆菌H37Rv株Hsp65 DNA为目的基因，构建重组质粒pEGHsp65，以其转染真核细胞，观测蛋白表达。再将其导入DC中，制备新型抗结核的DC疫苗。 本研究根据结核分枝杆菌基因序列，设计一对PCR引物，以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的总DNA为模板，经过PCR循环扩增出Hsp65目的基因，将回收的PCR产物和载体pEGFP-C1用限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoR Ⅰ双酶切，再用T4DNA连接酶连接，筛选得到的pEGHsp65阳性克隆经酶切鉴定和DNA测序鉴定。用质脂体方法将重组质粒转染入真核细胞（人宫颈癌细胞Hela细胞），在共聚焦显微镜下观测荧光表达强弱，以调整优化转染条件。分别收集pEGHsp65、pEGFP-C1质粒转染的Hela细胞，提取总RNA进行逆转录得到cDNA，将其作为模板，加入Hsp65特异性引物进行PCR测定，并在PCR反应体系中补加内参（β-actin）引物作为对照。无菌取小鼠骨髓细胞，加入细胞因子rmGM-CSF、rmIL-4培养，第8d收集细胞分别用光镜和电镜对诱导的DC进行形态学鉴定。将空载体质粒和重组质粒分别转染入DC中，同时设立未转染的细胞对照组。转染48 h后在共聚焦显微镜下观测荧光表达的强弱。用MTT比色法检测DC疫苗刺激小鼠未致敏脾细胞的增殖。 结果显示：重组质粒pEGHsp65经BglⅡ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定和DNA测序鉴定证实H37Rv株Hsp65 DNA已插入重组表达载体pEGFP-C1中；将重组质粒转染入Hela细胞，24 h即可观察出转染细胞有荧光蛋白的表达，48 h表达荧光蛋白的细胞数最多，培养72、96 h表达荧光蛋白的细胞数有所下降，强度减弱；RT-PCR检测到重组质粒转染的细胞中有Hsp65 mRNA的表达;光镜和电镜对诱导的DC进行了形态学鉴定。用MTT比色法检测到DC疫苗能引起未致敏脾细胞增殖。 本课题初步完成了结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备。为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。