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目的:以牙龈卟啉单胞菌牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2和菌毛蛋白基因fim A为目的基因,以SD大鼠IL-15基因为免疫佐剂,构建稳定高效的真核表达质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15和p VAX1-HA2,体外实验观察目的基因HA2、fim A和佐剂基因IL-15 m RNA水平的表达及免疫佐剂IL-15蛋白的表达,为下一步实验提供实验基础和物质条件。方法:本实验共分为三部分:第一部分:真核表达质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15、p VAX1-HA2的构建1.牙龈卟啉单胞菌的总DNA的提取、SD大鼠的总RNA的提取及逆转录,获得目的基因HA2、fim A、IL-15基因及IRES序列,二次拼接将基因串联获得HA2-fim A/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fim A、fim A/IL-15、HA2片段,同时插入酶切位点Xho I、Nhe I。2.目的片段HA2-fim A/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fim A、fim A/IL-15、HA2以及载体p VAX1的Xho I、Nhe I双酶切。3.将p VAX1片段与目的片段HA2-fim A/IL-15、HA2/IL-15、HA2-fim A、fim A/IL-15、HA2进行拼接获得阳性克隆,转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,同时进行测序鉴定。第二部分:重组质粒在真核细胞中m RNA水平的检测1.人源肾上皮细胞293T细胞的培养2.重组质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15、p VAX1-HA2转染293T细胞,同时设计空白对照组,转染24h后提取293T细胞的总RNA,进行逆转录。3.分别根据目的基因的序列设计特异性引物,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳验证其大小,扩增产物同时进行测序,结果进行BLAST比对。第三部分:重组质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-fim A/IL-15在真核细胞中IL-15蛋白表达水平的检测1.293T细胞的培养及重组质粒转染293T细胞2.ELISA定量检测IL-15表达量(1)293T细胞总蛋白及上清蛋白的收集(2)IL-15蛋白标准曲线的绘制及待测蛋白的检测,并对实验结果进行统计学分析。结果:1.重组质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15和p VAX1-HA2经酶切及测序鉴定,目的基因HA2、fim A及IL-15定向插入至真核表达质粒p VAX1,中间连接IRES序列与设计一致,插入位置正确,目的基因读码框未发生改变。2.五个重组质粒分别转染293T细胞,RT-PCR扩增目的基因HA2、fim A、IL-15,可见单一目的条带,大小与预计相同,测序结果与NCBI进行BLAST比对,与已公布的基因序列相同。3.绘制出IL-15的标准曲线,并检测出IL-15表达量,结果表明p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-fim A/IL-15与p VAX1阴性对照组及空白对照组比较,差异均具有统计学意义(p﹤0.05)。结论:成功构建真核表达质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15、p VAX1-HA2-fim A、p VAX1-fim A/IL-15、p VAX1-HA2,经脂质体转染真核细胞293T细胞后,RT-PCR证实目的基因在m RNA水平能够被正确表达,ELISA证实重组质粒p VAX1-HA2-fim A/IL-15、p VAX1-HA2/IL-15和p VAX1-fim A/IL-15中IL-15在蛋白水平能够表达。