超高分辨率显微成像能够展示生物分子纳米尺度的精确定位，是成像领域的研究热点和发展趋势。荧光蛋白是一种生命科学领域必不可少的光学成像工具，荧光蛋白可以被用来进行活细胞成像，运用荧光蛋白可以标记蛋白的表达，有些蛋白质组学的实验也可以通过利用荧光蛋白来实现，绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)、橙色荧光蛋白(orange fluorescent protein, OFP)是目前比较常用的荧光蛋白，这些荧光蛋白被广泛的应用到细胞成像中。最早的红色荧光蛋白DsRed是从珊瑚虫中克隆出来的，在紫外光的照射下可发射红色荧光，应用前景广泛。但是它自身还存在着很多的缺陷，比如DsRed的寡聚状态表现为四聚体，而且它的成熟时间长，在细胞内容易产生细胞毒性等。这些缺陷对其应用造成了一定的限制，因此，对其进行分析以及优化是十分必要的。在第二章中，对生物成像和生物医学领域常用的红色-橙色荧光蛋白：mCherry,mOrange, rsTagRFP, mOrange2, mKate2, mApple通过构建得到了其原核表达的质粒，将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达并纯化。纯化出来的荧光蛋白通过沉降速率进行分析从而得到其寡聚状态，为了对实验结果做进一步的验证我们又将这些红色荧光蛋白进行沉降平衡实验，通过沉降平衡的数据我们可以得到这些蛋白的相对分子量和Kd值然后分析得出荧光蛋白的寡聚状态。将两次实验所得的结果进行比对可以发现两次实验所得的结果是一致的，从而确定的给出了关于红色荧光蛋白mCherry. mOrange, rsTagRFP, mOrange2, mKate2, mApple寡聚状态性质的信息。在第三章中，结合第二章得到的蛋白寡聚状态的性质我们将这些荧光蛋白与Orai1细胞膜蛋白进行融合并进行共聚焦显微成像，共聚焦显微成像的结果显示除了mCherry之外，其他荧光蛋白的定位结果都与沉降平衡与沉降速率的结果一致。通过对mCherry的性质通过共聚焦显微成像进一步分析发现Orai1-mCherry的聚集是出现在溶酶体中的。通过与细胞自噬标记蛋白共定位的结果排除了mCherry引起细胞自噬的可能。经过一系列的试验之后将mCherry与mOrange2的碱基序列进行对比，在比对结果的基础上对mCherry进行了饱和定点突变，然后通过共聚焦显微成像对突变后的结果进行鉴定，最终筛选出与Orai1融合之后在细胞膜内定位效果较好的红色荧光蛋白。第四章中我们主要对超分辨显微成像技术进行了研究，首先将mEos3.1和mEos3.2分别与肌动蛋白β-actin和α-actin融合表达，然后再进行单分子成像实验，来探究mEos3.1和mEos3.2的单分子特性，通过(荧光)光敏定位显微镜/随机光学重构显微镜成像使用软件重构后发现其成像效果比普通的荧光蛋白的成像效果更好一些，于是为超分辨成像提供一种新的荧光蛋白工具。随后的实验我们研究了随机光学重构显微成像技术中的STORM缓冲液，并用抗坏血酸来替代STORM缓冲液然后进行了一些列的随机光学显微成像实验并证实了用抗坏血酸可以替代STORM缓冲液来进行随机光学重构显微成像。