【摘 要】
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相比于化学药物,蛋白质药物因其具有活性高、副作用小、特异性强等独特优势已越来越多的被应用于癌症治疗。然而,蛋白质药物的应用仍然面临着稳定性差、膜渗透性低、易被酶解失活、生物利用率低下等问题。此外,由于大多数蛋白质药物没有荧光,且已有的蛋白质标记方法有一定的局限性,从而导致蛋白质进入细胞后,难以获得其生物分布及代谢信息。因此,本论文构建了一种pH和H2O2双响应的纳米粒子MNPs@PDA@PEG/S
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相比于化学药物,蛋白质药物因其具有活性高、副作用小、特异性强等独特优势已越来越多的被应用于癌症治疗。然而,蛋白质药物的应用仍然面临着稳定性差、膜渗透性低、易被酶解失活、生物利用率低下等问题。此外,由于大多数蛋白质药物没有荧光,且已有的蛋白质标记方法有一定的局限性,从而导致蛋白质进入细胞后,难以获得其生物分布及代谢信息。因此,本论文构建了一种pH和H2O2双响应的纳米粒子MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try,以实现蛋白质细胞内安全高效递送及其控制释放的可视化监测。MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try的制备过程如下:1)首先以Fe3O4纳米粒子（MNPs）为核,借助多巴胺的氧化自聚制备聚多巴胺（PDA）包被的纳米粒子骨架（MNPs@PDA）;2)利用氨基、巯基与PDA的反应活性,顺序将氨基修饰的水杨异羟肟酸（SHA）和巯基修饰的聚乙二醇（PEG-SH）共价链接到PDA的表面,制备MNPs@PDA@PEG/SHA纳米粒子;3)通过水杨异羟肟酸分别与4-羧基苯硼酸（PBA）修饰的QCy7-PBA及Try-PBA反应,将QCy7和Try负载到纳米粒子上制得目标纳米粒子MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try。该纳米粒子在中性pH时,PEG形成蛋白的保护层,使其免受蛋白酶的降解;而在较低pH条件下,水杨异羟肟酸与硼酸反应形成的硼酸/水杨异羟肟酸共价键断裂,一方面释放出Try-PBA使得蛋白活性得以恢复;另一方面释放出的QCy7-PBA被H2O2氧化,生成QCy7,使近红外荧光得以恢复,实现蛋白控制释放的可视化检测。论文的主要研究内容和结果如下:1.SHA和QCy7-PBA的合成及表征:本论文首先合成了关键化合物SHA和QCy7-PBA,并采用核磁和质谱分析技术对其进行了结构鉴定。采用紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计对QCy7-PBA的H2O2响应性研究的结果表明,QCy7-PBA可以选择性的对H2O2产生响应,实现近红外荧光的恢复。2.胰蛋白酶的修饰及活性研究:本论文以胰蛋白酶（Try）为模型蛋白质,用PBA修饰Try的赖氨酸残基,得到PBA修饰的胰蛋白酶（Try-PBA）。聚丙烯酰胺凝胶电泳和ARS荧光滴定实验分析结果表明每当量Try平均结合23.5当量的PBA。圆二色谱和TAME比色吸光度分析结果显示Try-PBA基本保持了Try的α-螺旋的二级结构,并且所用蛋白修饰方法对Try的生物活性没有明显影响。3.纳米粒子MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try的制备与表征:以MNPs@PDA为骨架,顺序将SHA和PEG-SH共价链接到PDA的表面,制备MNPs@PDA@PEG/SHA纳米粒子后,再分别与QCy7-PBA及Try-PBA反应,制得MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try。采用DLS、UV-Vis、TEM、FTIR和XPS分析技术对目标纳米粒子进行了详细的表征:动态光散射分析结果显示其水合粒径为462.0 nm,ζ电势为-24.5 m V;UV-Vis和FTIR分析表明纳米粒子的特征峰均能与所修饰化合物的特征峰吻合;XPS分析表明Fe、O、C、N元素含量随着纳米粒子修饰不同化合物而发生相应变化;透射电子显微镜图显示纳米粒子MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try的最外面有明显的灰色包层。综合分析结果,说明论文成功制备了目标纳米粒子。4.Try的胞内递送研究:论文以人肺癌细胞A549进行MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try细胞内蛋白递送的研究。通过共聚焦显微镜（CLSM）和流式细胞术（FACS）,对A549细胞摄取纳米粒子和胰蛋白酶在A549细胞内递送及释放情况进行研究,表明随着时间延长,A549细胞可以对MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/FITC-Try进行有效的摄入。通过Lyso Tracker Red对溶酶体染色后进行共定位分析,表明FITC-Try-PBA可以从核内体及溶酶体成功逃逸,实现蛋白质安全高效递送。通过共聚焦显微镜对QCy7-PBA的蛋白质可视化监测能力进行研究,表明随时间的延长,QCy7发出的近红外荧光越来越强,实现了QCy7-PBA对蛋白质递送和控制释放的可视化监测。通过MTT法和Annex V-FITC/PI凋亡试剂盒对纳米粒子MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try的抗癌效果进行研究,证明MNPs@PDA@PEG/SHA-QCy7/Try浓度为0.25 mg m L-1时,培养3 h后A549细胞存活率为15.2%,表现出理想的抗癌效果。
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