胺氧化酶基因克隆、异源表达及其对伏马毒素降解能力的研究

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伏马毒素(Fumonisins,FB)主要是由镰刀菌属等真菌产生的代谢产物,是一种污染分布较为普遍的真菌毒素。产毒菌及伏马毒素主要存在于一些玉米和小麦等粮食作物及其制品,这就导致其随着食物链的传递危害到人畜的健康。近年来粮谷食品安全污染方面遭受霉菌毒素的危害及其严重,其中伏马毒素对粮食危害的占比也在逐渐提高,而伏马毒素的危害中伏马毒素B1(FB1)的毒性最强,污染最为严重。因此如何降解伏马毒素B1成为了研究热点。胺氧化酶(Amine Oxidase,AO)是一类能够催化胺类氧化脱氨基的特殊蛋白质。目前国内外利用胺氧化酶降解伏马毒素B1的研究匮乏,因此对胺氧化酶降解伏马毒素B1进行研究是非常有必要的。本论文的研究结果如下:(1)将筛选的6个胺氧化酶基因在大肠杆菌表达系统中进行异源表达后,对其重组蛋白通过高效液相色谱进行伏马毒素B1的活性分析,成功获得3个新的具有伏马毒素降解能力的胺氧化酶ACAO、ASAO和NDAO。(2)通过LC-MS初步分析了羧酸脂酶和胺氧化酶的对伏马毒素B1的降解产物,推测了羧酸脂酶和胺氧化酶降解伏马毒素B1的途径。(3)分别对胺氧化酶ACAO、ASAO和NDAO进行了酶学性质分析。胺氧化酶ACAO和ASAO的最适温度为45℃,NDAO为40℃;胺氧化酶ACAO在45℃高温环境中反应60 min仍可以保持71.86%的相对活力;胺氧化酶ACAO、ASAO和NDAO的最适p H都为9;当p H=10时,胺氧化酶ACAO和ASAO均表现出99.36%、93.60%的相对活性,当p H=11时,NDAO仍具有91.51%的相对活性,说明这3个酶均具有较强耐碱性。(4)分别分析了胺氧化酶ACAO、ASAO和NDAO最佳诱导条件,同时对胺氧化酶ACAO分析了不同His标签位置和共表达伴侣蛋白对胺氧化酶的表达量的影响,发现胺氧化酶ACAO-C-p G-KJE8的蛋白表达量较优化前提高了321.77%;(5)对羧酸脂酶Fum DPS和胺氧化酶ACAO的基因进行了不同的柔性和刚性linker连接的融合载体的构建,成功表达了融合蛋白,通过HPLC的结果发现,5种融合蛋白都具有降解伏马毒素B1的能力。结合融合蛋白表达量及活性结果分析得出,刚性linker连接的融合蛋白的表达量比柔性的要高;对比linker的长度,发现较长的linker对于融合蛋白的表达是更有利的;5组不同linker连接的融合蛋白的活性各不相同,其中由(G4S)~3linker组成的融合蛋白活性最高。
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