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纤维素是世界上最广泛存在、最丰富的可再生资源。纤维素的生物降解需要纤维素酶的酶解作用。而纤维素酶是一种复合酶系，主要包括内切-β-1,4-D-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、外切-β-1,4-D-葡聚糖酶(E.C.3.2.9.11)和β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)。
福寿螺多功能纤维素酶(MFC)同时具有内切-β-1,4-D-葡聚糖酶、外切-β-1,4-D-葡聚糖酶和内切-β-1,4-D-木聚糖酶3种酶活性，能高效分解天然纤维素，在食品、饲料、生物能源、生物基化学品、纺织、造纸、环境保护、医药等领域具有非常广泛的用途。因此，克隆多功能纤维素酶基因并在合适的宿主中高效表达以大量制备生产多功能纤维素酶，对于国民经济建设和社会可持续发展具有十分重要的意义。
本研究从福寿螺的胃组织中克隆出多功能纤维素酶基因(mfc)。采用不同的食用菌启动子构建了6个mfc的食用菌表达载体，利用PEG介导原生质体的方法转化高等真菌灰盖鬼伞，研究多功能纤维素酶基因在灰盖鬼伞中的表达。主要结果如下：
(1)克隆了多功能纤维素酶基因
采用RT-PCR方法从福寿螺胃组织中扩增出多功能纤维素酶基因(mfc)。该基因全长为1225 bp，上游5’端非翻译区有19 bp，下游3’端非编码区21 bp，开放阅读框1185 bp，编码395个氨基酸。同源性比对结果显示，该基因以及推测的氨基酸序列与已报道的egx(GenBank Accession No：AAP31839)的同源性分别为99.3％和99.8％，在8个位点出现核苷酸差异，有1个位点出现氨基酸残基差异(颉氨酸变为丙氨酸)；该基因与福寿螺木聚糖酶基因的同源性为87％。
(2)克隆了金针菇gpd-Fv启动子
根据Genbank登录的金针菇gpd启动子序列设计两对引物，对金针菇基因组DNA进行PCR扩增。DNA测序结果表明，PCR扩增片段长度分别为1412 bp和752 bp。同源性分析结果表明，这2个DNA片段的序列与金针菇gpd启动子基因(Genbank:AF515622.1)的同源性分别为95％和98％。
(3)构建了多功能纤维素酶基因的6个食用菌表达载体
利用克隆的多功能纤维素酶基因和6个食用菌gpd启动子gpd-Les(香菇gpd，613 bp)、gpd-Lel(香菇gpd，1056 bp)、gpd-Ab(双孢蘑菇gpd，275 bp)、gpd-Vv(草菇gpd，613 bp)、gpd-Fvs(金针菇gpd2，752 bp)、gpd-Fvl(金针菇gpd1，1412bp)连接，同时以表达载体pBluescriptⅡKS(+)为框架，构建食用菌基因表达载体。
重组质粒经过PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，这6个表达载体分别命名为pgLes-mfc (香菇gpd，613 bp)、pgLel-mfc(香菇gpd，1056 bp)、pgAb-mfc(双孢蘑菇gpd，275 bp)、pgVv-mfc(草菇gpd，613 bp)、pgFvs-mfc(金针菇gpd2，752 bp)和pgFv1-mfc (金针菇gpd1，1412 bp)。
(4)获得了多个转多功能纤维素酶基因的灰盖鬼伞工程菌株
采用PEG介导的原生质体转化方法，分别将食用菌基因表达载体pgLes-mfc、pgLel-mfc、pgAb-mfc、pgVv-mfc、pgFvs-mfc、pgFvl-mfc与灰盖鬼伞恢复载体pCc1001共转化灰盖鬼伞色氨酸营养缺陷型菌株LT2。共转化子经过多功能纤维素酶基因的PCR鉴定和Southern杂交鉴定，该6个表达载体分别获得9个、7个、11个、9个、8个、5个真实阳性转化子，这些转化子分别命名为Clesm、Clelm、Cabm、Cvvm、Cfvsm、Cfvlm。
(5)建立了灰盖鬼伞工程菌株的重组多功能纤维素酶的筛选检测体系
通过不同培养基的试验比较，确立了灰盖鬼伞工程菌株表达多功能纤维素酶的培养基为：0.2％酵母提取物，0.1％NH4NO3，0.05％CMC-Na。通过不同酶活测定方法的试验比较，确立了灰盖鬼伞工程菌株的重组MFC酶活测定体系为：培养9-11天MFC酶活达到高峰时进行测定，酶促反应应该为30 min，反应温度应该为50℃，pH为5.0。
(6)筛选获得了较高水平表达MFC的灰盖鬼伞工程菌株
对转化获得的总共49个转化子(来源于6种启动子构建的6种表达载体)的多功能纤维素酶(MFC)的表达水平进行检测筛选，结果表明：来源于不同启动子的转化子之间的MFC表达水平具有显著差异，FPA酶活的高低顺序为Cabm(0.208 U/ml)>Cfvlm(0.201 U/ml)>Cfvsm(0.179 U/ml)>Clesm(0.176 U/ml)>Clelm(0.169 U/ml)>Cwm(0.153 U/ml)>CK(0.127 U/ml);CMC酶活高低顺序为Cvvm(0.423 U/ml)>Cfvlm(0.380 U/ml)>Clelm(0.378 U/ml)>Clesm(0.371 U/ml)>Cabm(0.368 U/ml)>Cfvsm(0.316 U/ml)>CK(0.273 U/ml)。来源于同一启动子的不同转化子之间的MFC表达水平也具有显著差异。
在总共49个转化子中，CMC酶活(内切葡聚糖酶活)最高的前十个转化子分别为：Cvvm12(0.525 U/ml)>Cabm44(0.478 U/ml)>Clesm33(0.461 U/ml)>Cvvm20(0.459 U/ml)>Clesm12(0.454 U/ml)>Cvvm2(0.445 U/ml)>Cfvlm9(0.428 U/ml)>Clelm28(0.42 U/ml)>Cvvm6(0.417 U/ml)>Clelm64(0.416 U/ml)，对照为0.273 U/ml；FPA酶活(全酶活)最高的前十个转化子分别为：Cabm44(0.258 U/ml)>Cabm66(0.249 U/ml)>Clesm13(0.239 U/ml)>Cabm67(0.235 U/ml)>Cfvlm19(0.232 U/ml)>Cfvlm10(0.229 U/ml)>Cabm40(0.228 U/ml)>Cabm3(0.227 U/ml)>Cfvsm20(0.226 U/ml)>Cfvsm52(0.225 U/ml)，对照为CK(0.127 U/ml)。在选择的12个灰盖鬼伞工程菌株中，木聚糖酶活最高的前6个转化子分别为：Clelm64(50.44 U/ml)>Crylm9(45.2 U/ml)>Clesm11(44.9 U/ml)>Cfvlm10(42.77U/ml)>Clesm13(41.36 U/ml)>Cabm67(40.99 U/ml)，对照的为19.41 U/ml。