苜蓿中华根瘤菌CCBAU 81024耐碱相关基因的研究

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通过菌株的耐碱性筛选,得到了一株能够耐受pHll.5的根瘤菌。经过16SrDNA部分序列、G+C mol%、DNA-DNA杂交的测定,鉴定其为苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti),其编号为CCBAu81024。 采用cDNA-AFLP技术,揭示了苜蓿中华根瘤菌CCBAu 81024在中性与碱性培养时基因表达的差异,并得到了总共8个差异表达的基因片段。其中2个基因片段为碱性表达时下调,6个基因片段为碱性表达时上调。TDFl定位于未知功能的基因SMb21696的编码框内;TDF2定位于基因fdxB与orf10.5编码框之间的非编码区,其功能和调控模式还需要进一步验证;TDF4定位于基因tfxG编码框内;TDF5一部分定位于基因SMc00062编码框中,另一部分定位于基因SMc00062上游;TDF6一部分定位于基因SMb20484的上游,一部分位于SMb20484编码区中,基因SMb20484与小分子物质的转运有关:TDF7一部分定位于基因y4qJ编码区中,另一部分定位于基因y4qK的编码区中;TDF8与疮疱丙酸杆菌的氨酰tRNA合成酶基因同源性达到98%。此外,对tfxG基因进行了较详细的研究。Southern杂交验证了tfxG基因在苜蓿中华根瘤菌CCBAU 81024是单拷贝存在的;Northern杂交证明了tfxG基因在中性培养时为低水平表达,碱性培养时上调表达,表达量约为中性时表达的50-100倍;利用同源重组进行tfxG基因的敲除,得到了tfxG基因缺失突变株,耐碱性实验表明缺失突变株耐碱性能下降,由野生型的pHll.5降低为突变株的pHl0.5;tfxG基因互补试验可以再次恢复突变株的耐碱性能。说明tfxG基因在菌株耐碱的过程中行使了某种功能。但行使何种功能还需要进一步的实验。 另外,初步探讨了tRNA在耐碱调控过程中的作用。也证明了LMwRNA这一技术不仅可以作为分类学上的一种遗传学方法,也可用米研究不同条件下tRNA是否发生改变等。tRNA图谱在pH7、8、9、10以及pH8碱激时的图谱类型基本上是一致的。pH9、10碱激处理的tRNA图谱类型基本一致,但是与pH7时的图谱类型具有较大的差异,差异条带主要位于tRNA class2区域。并且几次重复实验都得到了相同的图谱类型,说明碱激时确实存在着tRNA组分或丰度的改变,也就是说tRNA在耐碱调控过程中起着某种重要的作用。
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