论文部分内容阅读
我国是杏和杏仁主产国之一,拥有丰富的杏仁资源。杏仁中蛋白质含量高达25%以上,但杏仁蛋白的研究和产品开发相对落后。以蛋白为原料开发功能性短肽是目前功能食品研究领域的热点,用特异的蛋白酶水解就有可能释放出杏仁蛋白中的活性肽段。本文以冷榨脱脂杏仁粕为原料,利用酶解法制备高得率、高水解度杏仁短肽,并明确了其功能活性,旨在为杏仁蛋白的合理利用和高效增值提供指导和理论依据。探讨了Alcalase、Protamex、Falvorzyme、N120P、Neutrase和木瓜蛋白酶对杏仁粕的水解效果,选取中性蛋白酶Neutrase与N120P进行复合酶解,对酶解过程中酶用量、底物浓度、pH、反应温度、反应时间等因素对水解效果的影响进行了系统地研究,通过正交旋转组合试验对复合水解的工艺参数进行了优化,建立了相关回归模型;结合生产实际确定出了Neutrase与N120P酶解杏仁粕的参数最佳组合为:Neutrase:N120P=2:1(U/U);最适pH6.5;酶解温度52.5℃,加酶量7200 U/g,底物浓度4%,酶解时间173 min。在此条件作用下短肽得率为65.49±1.22%,水解度为26.20±0.35%。杏仁蛋白酶解产物分子量较低,其中小于1 kDa短肽占74.39%;采用超滤技术对杏仁短肽进行分离,研究了操作压力、料液浓度和操作温度对超滤过程的影响,确定了杏仁短肽一级超滤的最适条件:操作压力20 psi、料液浓度4%、操作温度35℃。二级超滤的最适条件:操作压力25 psi、料液浓度6%、操作温度40℃。经过两级超滤处理的杏仁短肽,分子量小于5 kDa的短肽得率为84.67%,分子量小于1 kDa的杏仁短肽得率为62.86%。利用体外化学模型对杏仁短肽的抗氧化活性和ACE抑制活性进行评价,证明杏仁短肽具有较强的抗氧化活性,其中小于1 kDa短肽抗氧化活性最强,清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基的IC50值分别为99.31 mg/mL,4.70 mg/mL,0.48 mg/mL,且具有较高的还原力和亚油酸氧化抑制能力。杏仁短肽各分子量组分的ACE抑制活性非常突出,其中小于1 kDa短肽的ACE抑制活性最高,短肽粗品、大于5 kDa、1-5 kDa和小于1 kDa组分的IC50值为0.37 mg/mL,0.82 mg/mL,0.43 mg/mL和0.14 mg/mL。对分子量小于1 kDa杏仁短肽的ACE抑制机理进行了研究,Lineweaver-Burk模型证明杏仁短肽属于非竞争性抑制剂,稳定性实验表明小于1 kDa杏仁短肽具有良好的热稳定性及pH稳定性,对消化酶的水解具有一定的抗性,属于真抑制型ACE抑制肽。动物实验结果表明用100 mg/kg体重以上剂量的小于1 kDa杏仁短肽饲喂原发性高血压大鼠(SHR),6 h内可显著降低大鼠的尾动脉收缩压值,且杏仁短肽对SHR大鼠的心率均无影响;多次给药动物实验结果表明以400 mg/kg体重以上剂量的小于1 kDa杏仁短肽饲喂的SHR大鼠,28天后的尾动脉收缩压显著减低(p<0.05),且降压作用平稳。连续采用Scphadex G-15凝胶过滤、半制备RP-HPLC和RP-HPLC等分离分析方法,从小于1 kDa的杏仁短肽中分离出一种活性较强的ACE抑制肽f1。采用MALDI TOF-TOF/MS方法和2D-NMR对上述ACE抑制肽进行了结构鉴定,其氨基酸序列为ILILLP,分子量679.6 Da,ACE抑制IC50值为0.067 mg/mL(98.58μM)。根据上述结果,采用固相合成方法人工合成了一条氨基酸序列相同的短肽ILILLP,对其ACE抑制活性进行验证,ACE抑制IC50值为0.077 mg/mL(114μM),活性较杏仁短肽ILILLP相比有所降低。对杏仁短肽制备工艺参数放大试验,最终得到短肽产品总得率为58.40%,水解度为23.90%,纯度大于50%,分子量小于10 kDa短肽占61.40%。放大实验所得短肽粗品ACE抑制IC50值为0.46 mg/mL。放大试验证明杏仁短肽制备工艺可以应用到杏仁短肽产业化中。