论文部分内容阅读
[目 的]耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌（Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE）是对任一种碳青霉烯类抗生素耐药或产碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌。本课题在前期研究的基础上筛选出18株产KPC-2型碳青霉烯酶的CRE菌株,对携带Tn6296质粒耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌的临床特征及质粒的基因环境进行初步分析,从可移动元件水平转移的角度解释耐药基因的传播机制,为临床抗感染治疗、预防和控制产KPC-2型碳青霉烯酶在肠杆菌目细菌中的传播提供有价值的实验室依据和理论支持。[方法]1.收集2020年2月至2021年9月期间云南省第二人民医院送检的临床CRE标本,根据本课题在前期研究的基础上筛选出18株产KPC-2型碳青霉烯酶非重复的菌株。采用MALDI-TOF MS进行菌种鉴定,VITEK2 Compact全自动系统进行药敏试验,运用mCIM联合eCIM试验进行产碳青霉烯酶的表型检测,采用PCR扩增技术检测常见碳青霉烯酶的耐药基因（blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM-2、blaOXA-48）。2.质粒特征分析:应用S1核酸内切酶脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）和Southern印迹杂交对携带blaKPC-2基因的质粒进行定位;采用质粒接合试验对携带blaKPC-2基因的质粒转移性进行分析。3.全基因组测序及生物信息学分析:blaKPC-2耐药基因定位明确后,本研究选择大肠埃希菌LQ52和密歇根克雷伯菌LS81进行了全基因组测序（Whole genome sequencing,WGS）。提取细菌DNA,基于二代illumina和三代Nanopore测序技术平台进行全基因组测序。获取菌株序列及携带blaKPC-2耐药基因的质粒全序列,使用 BLAST、ResFinder、ISFinder、the Tn Number Registry 等软件分析该质粒的复制子、移动元件、耐药基因等信息,进一步探讨blaKPC-2耐药基因所在质粒中的基因环境。[结 果]1.药敏结果显示这1 8株菌株对青霉素类、青霉素类加酶抑制剂、头孢菌素类、喹诺酮类抗生素和氨基糖苷类表现出高水平耐药。2.mCIM联合eCIM试验检测碳青霉烯酶表型,18株实验菌株均为mCIM试验阳性,eCIM试验阴性,提示均产丝氨酸型碳青霉烯酶;碳青霉烯酶耐药基因型检测经一代测序证实均为blaKPC-2耐药基因。3.blaKPC-2基因的定位结果:blaKPC-2基因大部分位于CRE菌株的质粒上,比例为94.4%（17/18）,且携带blaKPC-2基因的质粒分子量大小不同,在～80kb至～130kb之间,其中最常见携带blaKPC-2基因的质粒大小约为～120kb（n=9）,其次约为～80kb（n=7）,～130kb（n=2）。4.质粒的转移性:接合成功的菌株有4株,分别是菌株LS81、LS82、LT91、LT92,同时验证了 H-LS81、H-LS82、H-LT91、H-LT92 为成功接合子,携带 blaKPC-2基因的质粒可成功转移到大肠埃希菌EC600;4株接合子携带的blaKPC-2基因均位于约～80kb大小的质粒上。5.生物信息学分析:本研究中最常见携带blaKPC-2基因的质粒大小约为～120kb,其次约为～80kb。blaKPC-2定位在约～120kb质粒的一株大肠埃希菌LQ52和blaKPC-2定位在约～80kb质粒的一株密歇根克雷伯菌LS81进行全基因组测序后,生物信息分析后显示:（1）大肠埃希菌LQ52属于ST131型,该菌株携带碳青霉烯类、β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磷霉素类、酰胺醇类、甲氧苄啶类耐药基因;大肠埃希菌LQ52携带blaKPC-2基因的质粒,命名为pLQ52-KPC（序列号:CP089447.1）,该质粒大小 125150bp,为 IncFII/IncR 型杂合质粒;（2）密歇根克雷伯菌LS81属于ST196型,该菌株携带碳青霉烯类、β-内酰胺类、氨基糖苷类耐药基因,密歇根克雷伯菌LS81携带blaKPC-2基因的质粒,命名为pLS81-KPC（序列号:CP089449.1）,该质粒大小81451bp,为IncM2质粒;（3）pLQ52-KPC和pLS81-KPC两质粒blaKPC-2基因环境相似,都位于一个典型的Tn6296转座子上,blaKPC-2位于ISKpn27和ΔISKpn6之间,形成一个ISKpn27-blaKPC-2-ΔISKpn6的核心结构共同携带blaKPC-2耐药基因。[结 论]产KPC-2型碳青霉烯酶的CRE菌株呈现多重耐药;blaKPC-2基因主要由质粒携带,同时质粒介导blaKPC-2基因的水平转移;本研究中blaKPC-2耐药基因位于转座子Tn6296中,以Tn6296的变体形式存在,具有核心结构ISKpn27-blaKPC-2-ΔISKpn6。本研究有助于深入理解产KPC-2型碳青霉烯酶的CRE的传播机制和基因环境的多样性,并期望通过新一代的基因编辑等技术对携带Tn6296质粒耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌在预防和治疗方法上提供思路。