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鲁氏耶尔森菌病,是由鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia Ruckeri,Y.Ruckeri)引起的养殖鱼类严重急性或慢性细菌性疾病。美国于1999年首次报道该菌感染斑点叉尾鮰并引起严重死亡。作为鲁氏耶尔森氏菌运动器官的鞭毛,其与该菌的致病性等密切相关。鞭毛主要是由鞭毛蛋白单体聚合而成,故对鞭毛蛋白的研究显得尤为重要。本实验根据实验室之前对鲁氏耶尔森氏菌SC09菌株的全基因组测序结果,克隆得到三个鞭毛蛋白基因FlaA,FlaB和FlaC,并通过生物信息学软件对FlaA,Fla 和FlaC基因的分子特性进行了分析。随后,原核表达此三个鞭毛蛋白,并通过免疫印迹验证三个表达产物的特异性。并对三个重组鞭毛蛋白的体内外免疫调节作用进行研究。具体研究结果如下:1鲁氏耶尔森氏菌三个鞭毛蛋白的克隆、表达及生物信息学分析以鲁氏耶尔森氏菌基因组脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid,DNA)为模板,扩增三条鞭毛蛋白基因序列。使用生物信息学软件对三条鞭毛蛋白序列进行分析。三个鞭毛蛋白FlaA、FlaB和FlaC完整开放性阅读框(Open Reading Fram,ORF)分别为1284 bp、1278 bp和1290 bp,编码蛋白的氨基酸个数分别为428个、426个和430个,预测的蛋白质大小分别为43.5268 KDa、43.63197 KDa和44.04248 KDa。三个鞭毛蛋白基因的氨基酸序列之间进行序列比对,相似性在72.46%-89.84%,与其他不同菌种的鞭毛蛋白氨基酸序列比对,相似性中等。结构域分析发现,三个鞭毛蛋白均在N-末端和C-末端分别含有一个Flagellin_N/C superfamily的保守结构域,且三个鞭毛蛋白均不含有信号肽切割位点和跨膜区域。进化树结果显示,所有的鲁氏耶尔森氏菌属全都分离到一个单独枝,本文中所涉及到的三个鞭毛蛋白显示出较近的同源性,同时与已报道的Yersinia flagellin(Y.ruckeri(AGL46983))的鞭毛蛋白的同源性最近。通过原核表达获得的纯化rFlaA、rFlaB和rFlaC,并对其特异性进行分析。结果显示含有重组质粒的表达宿主菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度34℃,异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-l-Thiogalactopyranoside,IPTG)浓度 0.1 mM,诱导时间 4h;表达的重组蛋白rFlaA,rFlaB和rFlaC均为64 kDa左右;Western-blotting结果表明rFlaA,rFlaB和rFlaC均具有较好的特异性。2鲁氏耶尔森氏菌三个鞭毛蛋白免疫刺激的比较研究为了比较三个重组鞭毛蛋白的免疫调节作用,我们将上述表达的三个重组鞭毛蛋白刺激斑点叉尾鮰原代头肾单核巨噬细胞4 h、8 h、12 h和24 h后,各个时间点分别收集细胞提取核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA),qPCR分别检测膜型Toll样受体5(Membrane-Anchored Toll-like Receptor 5,TLR5M),可溶型 Toll 样受体 5(Soluble Toll-like Receptor 5,TLR5S),核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB),主要组织相容性复合体 Ⅱ(Major Histocompatibility Complex Ⅱ,MHCⅡβ),白细胞介素-1 β(Interleukin 1 β,IL1-β1),肿瘤坏死因子 α(TumorNecrosis Factor α,TNF α),白细胞介素 8(Interleukin 8,IL8),诱导型一氧化氮合成酶 1(Induced Nitric Oxide Synthase 1,iNOS1)和 Hepcidin的表达量。结果显示三个重组鞭毛蛋白都可以刺激上述九个基因表达量的上升,三个重组鞭毛蛋白比较发现rFlaC刺激上述九个基因表达量皆高于rFlaA和rFlaB对于上述九个基因表达量。此外,将表达的三个重组鞭毛蛋白免疫健康的斑点叉尾鮰8h、1 d、3 d、1 w、2 w和4 w后,各个时间点分别摘取其头肾组织提取RNA,qPCR分别检测TLR5M,TLR5S,NF-κB,MHCⅡβ,IL1-β1,TNFα,IL8,iNOS1和Hepcidin 的表达量。结果显示三个重组鞭毛蛋白也都可以刺激上述九个基因表达量的上升,三个重组鞭毛蛋白比较发现rFlaC也刺激上述九个基因表达量皆高于rFlaA和rFlaB对于上述九个基因表达量。