论文部分内容阅读
目的:砷是自然界中广泛存在的类金属元素,其可以穿过血脑屏障,引起人类广泛的神经系统并发症。神经突生长在神经发育过程中对于神经可塑性和记忆功能至关重要,砷暴露可以抑制神经突生长,这可能是砷诱导中枢神经系统损伤的潜在机制。自噬（Autophagy）是一种进化上保守的应激反应过程,参与神经元细胞骨架的调节,调节突触的发生和发育。自噬通量改变可能是导致许多中枢神经系统疾病中神经元细胞死亡的重要因素之一,但是自噬通量改变的分子机制尚不清楚。波形蛋白（Vimentin）是一种中间丝蛋白,在神经细胞神经突延伸中发挥重要作用,且与自噬密切相关。因此本研究拟采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模拟人神经元,建立砷染毒的体外细胞模型,探究砷暴露导致自噬通量改变引起神经突生长异常的相关机制,为自噬如何调节神经突生长和砷的神经毒性相关机制提供了新的证据。方法:采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系,全反式维甲酸（ATRA）10μM处理细胞形成已分化的神经元表型,建立砷暴露神经突生长损害的体外模型。细胞分组为DMSO溶剂对照组、ATRA对照组、NaAsO2组（5、10、15μM）、NAC组、NaAsO2+NAC组、SP600125组、NaAsO2+SP600125组、海藻糖（Trehalose）组、NaAsO2+Trehalose组。在染毒前30或60分钟使用干预剂处理细胞,随后用15μM NaAsO2染毒24小时。染毒结束后采用结晶紫染色光镜下检测神经突生长情况,荧光显微镜检测ROS荧光强度,Western Blot法检测Vimentin、MAP-2、JNK、p-JNK、CTSB、LC3、P62、LAMP-1、LAMP-2蛋白表达水平,免疫荧光法检测P62、LAMP-2表达量和分布情况。结果:1.NaAsO2暴露导致SH-SY5Y细胞神经突生长异常NaAsO2暴露后,结晶紫染色结果显示,已分化的SH-SY5Y细胞平均神经突数、平均神经突长度和有神经突细胞比例显著减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Western Blot结果显示Vimentin和MAP-2蛋白表达显著下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.NaAsO2暴露导致SH-SY5Y细胞ROS/JNK/CTSB信号通路激活NaAsO2暴露后,荧光显微镜观察,随着NaAsO2暴露剂量的增加,细胞内荧光强度逐渐增强,细胞内ROS水平升高;Western Blot结果显示,JNK蛋白磷酸化水平升高的同时,CTSB蛋白的表达量下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.NaAsO2暴露导致SH-SY5Y细胞自噬通量改变NaAsO2（5、10、15μM）暴露24小时后,Western Blot结果显示,LC3、P62、LAMP-1、LAMP-2蛋白表达水平增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）;免疫荧光结果显示P62、LAMP-2荧光强度增加,呈现聚集点状分布。4.抑制ROS减轻NaAsO2暴露所致SH-SY5Y细胞神经损伤与NaAsO2（15μM）处理组相比,荧光显微镜观察,NAC处理后,ROS荧光强度显著低;结晶紫染色结果显示,NAC处理后细胞平均神经突数、平均神经突长度和有神经突细胞比例降低的情况有所减轻,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Western Blot结果显示,与NaAsO2处理组相比,NAC处理后Vimentin、MAP-2、CTSB蛋白表达水平上升,p-JNK/JNK、LC3、P62、LAMP-1、LAMP-2蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;免疫荧光结果显示,与NaAsO2处理组相比,NAC处理后,P62、LAMP-2荧光强度降低,聚集分布减弱。5.抑制JNK磷酸化减轻NaAsO2暴露所致的SH-SY5Y细胞神经损伤与NaAsO2（15μM）处理组相比,结晶紫染色结果显示,SP600125处理后细胞平均神经突数、平均神经突长度和有神经突细胞比例降低的情况有所减轻,差异具有统计学意义（P＜0.05）;Western Blot结果显示,与NaAsO2处理组相比,SP600125处理后Vimentin、MAP-2、CTSB蛋白表达水平上升,p-JNK/JNK、LC3、P62、LAMP-1、LAMP-2蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;免疫荧光结果显示,与NaAsO2处理组相比,SP600125处理后,P62、LAMP-2荧光强度降低,聚集分布减弱。6.恢复自噬通量减轻NaAsO2暴露所致的SH-SY5Y细胞波形蛋白表达下降Western Blot结果显示,与NaAsO2处理组相比,NaAsO2+Trehalose组LC3、Vimentin蛋白表达上升、P62、LAMP-1、LAMP-2蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;免疫荧光结果显示,与NaAsO2处理组相比,Trehalose处理后,P62、LAMP-2荧光强度降低,聚集分布减弱。结论:1.NaAsO2暴露可引起SH-SY5Y细胞神经突生长异常。2.NaAsO2暴露通过ROS/JNK/CTSB信号通路介导SH-SY5Y细胞自噬通量改变。3.NaAsO2暴露致SH-SY5Y细胞自噬通量改变通过降低波形蛋白的表达引起神经突生长异常