研究背景肝细胞癌是最常见的我国消化道恶性肿瘤之一,发病率排第五位,死亡率占排在肿瘤相关死亡因素的第二位。尽管肝癌治疗手段有很多,包括化疗,放疗,手术以及分子靶向治疗,但肝癌患者总体生存率仍十分低。目前在临床上,化疗仍然是中晚期肝癌患者的主要选择。然而,部分肝癌患者对化疗药物原发耐药,或在治疗一段时间后,药物敏感性降低,是影响化疗药物在肝癌治疗效果的重要原因。化疗细胞毒性大也是限制化疗在肝癌治疗中的应用。因此,探索新型有效的治疗药物,以及寻找新的临床治疗策略是肝癌治疗的当务之急。近年来,由于中药的天然产物副作用小,治疗效果明显,受到越来越多的关注。槐耳是我国重要的药用真菌之一,最早的用药历史见于本草纲目。近20年来,槐耳因其明显的抗肿瘤效果,广泛应用于临床治疗中,其主要适应症包括晚期肝癌、进展期乳腺癌等。临床证据显示,槐耳清膏无论是单独应用或是联合化疗或者放疗,都取得了一定的疗效。但是,槐耳清膏的具体抗肿瘤机制尚不清楚。在一定条件下,如炎症反应、氧化应激时,内质网应激有利于细胞向恶性转变,并促进肿瘤细胞的增殖,减少细胞凋亡。内质网应激也还可以通过调节细胞中其他重要生理病理过程,如细胞凋亡、细胞自噬和诱导肿瘤细胞耐药等,参与肿瘤增殖并促进肿瘤转移。而在槐耳清膏的抗肿瘤作用中,内质网应激究竟发挥何种作用,尚未有文献报导。本课题研究槐耳清膏的抗肿瘤机制以及初步探讨内质网应激在这一过程中所发挥的作用。目的:1.观察槐耳清膏对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响2.观察内质网应激在槐耳清膏对肝细胞癌中影响并初步探讨其作用机制。方法:1.设置不浓度梯度槐耳清膏组,与肝癌细作用24h,采用MTT法检测细胞抑制率,计算槐耳清膏抑制肝癌的IC50。2.设置不同浓度梯度槐耳清膏组,与肝癌细胞24h后,流式细胞术检测各组细胞凋亡发生率。Western blot方法检测不同浓度梯度作用后的肝癌细胞中Bax,Bcl-2。3.不同浓度梯度槐耳清膏与肝癌细胞作用24h后,Western blot方法检测内质网应激相关标志蛋白GRP78,IRE1,PERK蛋白表达情况。4.使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸预处理肝癌细胞,再给予槐耳清膏刺激肝癌细胞,MTT法检测各组细胞活性。5.流式细胞学和Western blot方法检测对照组、槐耳清膏组、4-苯基丁酸组、4-苯基丁酸联合槐耳清膏组,各组中肝癌细胞中凋亡发生率以及Bax,Bcl-2,蛋白表达情况。结果:1.槐耳清膏可以抑制肝癌细胞的增殖,并随着浓度的升高,槐耳清膏抑制效率也增强。槐耳清膏在Hep3B细胞上的IC50是4.2mg/m L,Hep G-2的IC50是5.5mg/m L。2.槐耳清膏可以有效诱导肝癌细胞发生凋亡,且有浓度依赖性。Western blot显示,槐耳清膏诱导下调肝癌细胞Bcl-2蛋白水平并上调Bax蛋白水平。3.槐耳清膏可以诱导肝癌细胞发生内质网应激,上调肝癌细胞中GRP78,IRE1,PERK蛋白表达。4.细胞活性实验结果显示:与空白对照组相比,4-苯基丁酸(500μM)组肝癌细胞未有明显变化。而与槐耳清膏(6mg/m L)组相比,4-苯基丁酸(500μM)联合槐耳清膏(6mg/m L)组中,肝癌细胞中活性显著降低。5.细胞凋亡结果显示:与空白对照组相比,4-苯基丁酸(500μM)组肝癌细胞未有明显变化。与槐耳清膏(6mg/m L)组相比,4-苯基丁酸(500μM)联合槐耳清膏(6mg/m L)组中,肝癌细胞凋亡发生率显著升高。Western blot结果显示:与槐耳清膏(6mg/m L)组相比,4-苯基丁酸(500μM)+槐耳清膏(6mg/m L)组中Bax蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平下降。结论:1.槐耳清膏可以的抑制肝癌细胞增殖,诱导肝癌凋亡,且呈现浓度依赖的特点。2.槐耳清膏可以诱导肝癌细胞发生内质网应激。3.槐耳清膏联合内质网应激抑制剂可以更加有效的抑制肝癌细胞的作用。