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目的:探讨c-Jun/AP-1在TF-FVIIa/PAR2促进结肠癌细胞株SW620细胞增殖、迁移中的作用;进一步分析该过程中AP-1的上游分子及其调控的效应分子,以阐明TF-FVIIa/PAR2促进SW620细胞增殖和迁移的分子机制。
方法:(1)采用Westernblotting检测PAR2激动剂(PAR2-AP)、凝血因子VIIa(FVIIa)、抗-PAR2抗体(a-PAR2)、抗-TF抗体(a-TF)等不同组合刺激SW620细胞后,胞内转录因子c-Jun总蛋白和磷酸化水平变化,从而分析PAR2-AP、FVIIa对SW620细胞c-Jun/AP-1通路的影响以及FVIIa的效应是否依赖细胞表面的PAR2和TF。(2)采用AP-1抑制剂姜黄素(curcumin)、PAR2-AP、FVIIa等刺激物或抑制物处理SW620细胞,分别用MTT法、Transwell法和流式细胞术观察PAR2-AP、FVIIa对细胞增殖、迁移和细胞周期时相分布影响以及curcumin对这些过程的干预效应。(3)SW620细胞经curcumin、PAR2-AP、FVIIa等不同组合处理后,以实时荧光定量PCR检测细胞MMP-9、TF、caspase-3mRNAs表达,以Westernblotting检测caspase-3蛋白表达,Xa生成法检测TF活性,进而分析AP-I抑制剂curcumin对TF-FVIIa/PAR2调控MMP-9、TF、caspase-3表达的干预作用。(4)利用PKCa抑制剂safingol、Ca2+螯合剂EGTA和thapsigargin、ERK1/2抑制剂U0126、p38抑制剂SB203580预处理细胞,以Westernblotting检测其对PAR2-AP、FVIIa诱导的c-Jun总蛋白和磷酸化表达的干预效应,从而分析TF-FVIIa/PAR2引起c-Jun/AP-1活化通路中的上游信号分子。
结果:(1)PAR2-AP(100μM)、FVIIa(10riM)均能引起c-Jun总蛋白和磷酸化水平增高;a-PAR2及a-TF能明显抑制FVIIa对细胞c-Jun/AP-1蛋白表达的影响,而同型对照抗体mopc-21无此效应。(2)PAR2-AP(100μM)、FVIIa(10nM)均能促进细胞活力、增强迁移能力,使细胞S期比率升高;curcumin能够明显削弱PAR2-AP、FVIIa对SW620细胞增殖、迁移及细胞周期分布的影响。(3)PAR2-AP(100μM)、FVIIa(10nM)能影响SW620细胞MMP-9、TF、caspase-3表达,而curcumin能够明显干预此效应。(4)PKCa抑制剂、ERK1/2抑制剂能够明显干预PAR2-AP、FVIIa对细胞c-Jun/AP-1蛋白表达的影响,而ca2+螯合剂、p38抑制剂无此作用。
结论:(1)在结肠癌细胞株SW620细胞,TF-FVIIa/PAR2的活化能够引起细胞内c-Jun/AP-1转录因子的激活。
(2)c-Jun/AP-1转录因子的激活对于TF-FVIIa/PAR2促进SW620细胞增殖与迁移过程是非常必要的。
(3)c-Jun/AP-1激活后通过促进MMP-9和TF表达、抑制凋亡蛋白caspase-3的表达,进而促进细胞的增殖与迁移,是其发挥作用的重要途径之一。
(4)在TF-FVIIa/PAR2诱导c-Jun/AP-1活化过程中,PKCa和ERK1/2是其关键上游分子。