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第一部分JAK2/STAT3信号通路在AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化过程中的机制研究背景：ARDS是临床常见病,肺纤维化是晚期ARDS典型病理改变。研究发现肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化是肺纤维化的重要发病机制,肺泡上皮细胞损伤后向成纤维细胞转变,此过程称为上皮向间质转分化,肾素-血管紧张素系统(RAS)在上皮细胞间质转分化过程中起着至关重要的作用。RAS系统发挥作用主要依赖于血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ),但AngⅡ参与上皮间质转分化的分子机制尚不清楚。蛋白酪氨酸激酶/言号转导和转录活化因子(JAK2/STAT3)信号通路是AngⅡ游的一种重要的胞内信号转导通路,目前研究证实此信号通路通过调控上皮向间质转分化来参与多个组织纤维化发生。但AngⅡ是否通过激活JAK2/STAT3信号通路诱导肺泡上皮细胞转分化,进而参与肺纤维化形成,目前尚不清楚,深入研究JAK2/STAT3信号通路诱导肺泡上皮细胞转分化的机制可以为肺纤维化的早期防治提供新的靶点。目的：研究JAK2/STAT3信号通路对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞间质转分化的影响。方法：(1)复制小鼠肺泡上皮细胞间质转分化模型,依次用浓度为0.1umol/l、lumol/l、 10umol/l的AngⅡ干预贴壁生长的MLE-12细胞,48h后收集蛋白,Western blot检测α-SMA表达,明确AngⅡ的最佳干预浓度。(2)将体外培养MLE-12细胞分为正常对照组、DMSO对照组、AngⅡ刺激组、AngⅡ+AG490组,正常对照组给予10ul PBS, DMSO对照组给予10umol/LDMSO+lumol/LAngⅡ, AngⅡ刺激组给予1 umol/L Ang Ⅱ, Ang Ⅱ+AG490组给予1 Oumol/L AG490+1umol/L Ang Ⅱ,干预30min后收集蛋白,采用Western blot检测信号通路蛋白：JAK2、磷酸化JAK2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达水平。(3)分组干预48h后收集蛋白,检测上皮细胞的标记物E-钙黏素(E-cadherin),间质细胞的标记物平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及促纤维化因子TGF-β的表达,通过上皮向间质转分化的标记物,评估JAK2/STAT3信号通路在参与AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化过程中的作用。(4)分组干预48h后,用CCK8法检测不同干预药物对MLE-12细胞活性的影响。结果：(1)不同浓度AngⅡ对MLE-12细胞表达α-SMA的影响。与空白对照组相比, lumol/1 AngⅡ干预48h后MLE-12细胞表达的α-SMA显著增加(P<0.05),继续增加AngⅡ干预浓度,MLE-12细胞表达的α-SMA未进一步增加,故本研究中采用lumol/l AngⅡ干预MLE-12细胞48h来复制肺泡上皮转分化模型。(2) AngⅡ上调MLE-12细胞中JAK2/STAT3信号通路蛋白的表达。正常体外培养的MLE-12较少表达p-JAK2、p-STAT3,加入AngⅡ诱导30min后JAK2、STAT3无明显变化,而反应信号通路活化状态的p-JAK2、p-STAT3水平则明显升高(P<0.01)。(3)JAK2抑制剂AG490抑制AngⅡ诱导的MLE-12细胞中JAK2/STAT3信号通路蛋白的活化。MLE-12细胞给予AG490预处理60min后,再给予AngⅡ诱导30min,发现MLE-12表达p-JAK2、p-STAT3的水平较AngⅡ刺激组明显下调(P<0.01)。(4) AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化。MLE-12在AngⅡ干预48h后,与对照组相比,E-cadherin的表达显著降低(P<0.01),α-SMA和TGF-β表达显著升高(P<0.01),说明AngⅡ能诱导MLE-12细胞发生上皮转分化,同时促进肺纤维化发生。(5)AG490可抑制MLE-12细胞中AngⅡ诱导的上皮转分化。给予AG490 10umol/L预处理60min后,发现同时α-SMA和TGF-β的表达较AngⅡ干预组明显降低(P<0.05),而E-cadherin的表达较AngⅡ刺激组明显上调(P<0.01)。该结果说明抑制JAK2/STAT3信号通路的活化可抑制AngⅡ诱导的上皮转分化过程。(6)细胞活力检测：不同干预药物对MLE-12细胞活性的影响无显著差异。结论：JAK2/STAT3信号通路参与AngⅡ诱导的MLE-12转分化过程。第二部分乙酰化修饰STAT3在AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞转分化过程中的机制研究背景：肺纤维化是临床常见病,上皮细胞向间质细胞转分化是肺纤维化的重要发病机制,我们的前期研究证实JAK2/STAT3信号通路参与AngⅡ诱导的肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化过程,阻断该信号通路可减轻AngⅡ诱导的肺纤维化。STAT3是一种重要的核转录因子,以往研究STAT3的激活主要集中在其磷酸化修饰上,最近的研究表明其乙酰化修饰在靶基因的转录在也同样其重要作用。近年来研究已证实STAT3乙酰化修饰在肾纤维化及其他组织纤维化中起重要的调控作用,但STAT3乙酰化修饰是否参与调控肺纤维化的形成,目前尚不清楚。目的：研究STAT3乙酰化修饰对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞转分化的影响。方法：(1)将体外培养的MLE-12分为正常对照组、DMSO对照组、AngⅡ刺激组、Ang Ⅱ+S AHA组,正常对照组给予10umol/L PBS, DMSO对照组给予10umol/L DMSO+lumol/L Ang Ⅱ, Ang Ⅱ刺激组给予1 umol/L Ang Ⅱ, Ang Ⅱ+SAHA组给予3umol/L SAHA+lumol/L AngⅡ,干预0.5h后收集蛋白,采用Western blot检测信号通路蛋白：STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、乙酰化STAT3的表达水平,评估乙酰化修饰STAT3对STAT3信号通路活化的影响。(2)分组干预MLE-12细胞48h后收集蛋白检测上皮细胞的标记物E-钙黏素(E-cadherin),间质细胞的标记物平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及促纤维化因子TGF-β的表达,评估乙酰化修饰STAT3信号通路对AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化的过程的影响。(3)分组干预48h后,用CCK8法检测不同干预试剂对MLE-12细胞活性的影响。结果：(1)组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA上调乙酰化STAT3的表达。给予SAHA干预30min后,MLE-12细胞中乙酰化STAT3的表达较对照组显著增加(P<0.05)。(2) Ang Ⅱ上调STAT3信号通路蛋白的表达。正常体外培养的MLE-12表达少量β-STAT3,加入AngⅡ诱导30min后,STAT3的表达无明显变化,而反应活化状态的p-STAT3水平则明显升高(P<0.01)。(3) SAHA抑制MLE-12中AngⅡ诱导的STAT3信号通路蛋白的活化。在AngⅡ干预前给予SAHA预处理60min,发现p-STAT3的表达较AngⅡ干预组明显下调(P<0.01)。(4) AngⅡ诱导小鼠肺泡上皮细胞向成纤维细胞转分化。AngⅡ干预MLE-1248h后,E-cadherin的表达显著降低(P<0.01),α-SMA和TGF-β表达显著升高(P<0.01),说明AngⅡ能诱导上皮转分化,同时促进肺纤维化发生。(5) SAHA可抑制AngⅡ诱导的上皮转分化。MLE-12给予SAHA预处理后,再给予AngⅡ刺激,发现α-SMA和TGF-β的表达较AngⅡ干预组明显降低(P<0.05),而E-cadherin的表达较AngⅡ刺激组明显上调(P<0.05)。该结果说明乙酰化修饰STAT3可抑制AngⅡ诱导的上皮转分化过程。结论：STAT3乙酰化修饰通过下调磷酸化STAT3的表达抑制AngⅡ诱导的肺泡上皮细胞间质转分化。