杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是杜仲科杜仲属落叶乔木,是一种名贵的产胶植物和中药材。杜仲是雌雄异株植物。杜仲雄花茶是营养成分和天然活性成分极其丰富的饮品。杜仲胶有很好的绝缘性,且耐酸、耐碱及耐海水缓蚀,可生产高强度海底电缆、制作高强度粘合剂等。杜仲雌株种皮杜仲胶含量丰富、提取率高、胶杂质少。杜仲胶提取时通常选用杜仲种皮,而在药用方面希望获得更多的雄株。因此,结合其生产用途,杜仲的种植具有一定的性别偏好性。然而杜仲通常种植十年后才开花从而分辨其性别。因此,杜仲雌雄株选育存在困难。嫁接是一种无性繁殖技术,嫁接对性别的选育已在生产上投入应用。嫁接的存活率受砧木和接穗细胞融合程度的影响。研究发现,β-1,4-葡聚糖酶有助于嫁接植物砧木和接穗的细胞融合。然而,在植物中提取β-1,4-葡聚糖酶过程繁琐、提取困难、杂质多、成本高。酵母工程菌在表达外源蛋白时容易操作、易于纯化、成本较低、活性较高并且可大规模生产。毕赤酵母表达系统是一种常用的蛋白表达系统,其优势在于可以对表达的蛋白进行翻译后修饰,相较于原核表达系统能够得到生物活性较高的蛋白。此外,它的蛋白得率也相对较高。因此,本研究旨在开发一款酵母工程菌来生产提高嫁接成活率的酶,为嫁接提供辅助工具。基于此目的,本研究拟通过毕赤酵母表达系统来表达杜仲β-1,4-葡聚糖酶,并将β-1,4-葡聚糖酶应用于杜仲嫁接,取得了以下的结果:1、杜仲β-1,4葡聚糖酶基因克隆及生物信息学分析本研究通过RT-PCR克隆技术,成功获得杜仲中编码β-1,4-葡聚糖酶的基因,该基因全长1917 bp,编码638个氨基酸。通过分析,此基因所编码蛋白的分子量为70.20 KDa,第84-106个氨基酸之间存在一个跨膜结构域,功能结构域位于121-601个氨基酸之间,共有七个糖基化位点,无信号肽。蛋白的二级结构预测结果显示,α螺旋所占比例为31.94%,β转角占比1.88%,无规则卷曲所占比例为52.82%。蛋白理化性质预测结果显示,该蛋白等电点为5.63,总负电荷残基数（Asp+Glu）为71,正电荷的残基（Arg+Lys）为55。在蛋白稳定性方面,不稳定指数为41.74,这个蛋白是不稳定蛋白。平均亲水指数为-0.313,为亲水性蛋白。2、杜仲β-1,4-葡聚糖酶酵母工程菌的制备基于生物信息学分析对杜仲β-1,4-葡聚糖酶基因进行优化并创制酵母工程菌。分析结果显示,其功能结构域区间外存在一个跨膜结构域,为提高酵母工程菌表达成功率,将目标蛋白跨膜结构域去掉后对C端胞外段进行表达。依据毕赤酵母密码子偏好性优化编码杜仲β-1,4-葡聚糖酶的密码子,以使其在酵母工程菌中能更好的表达。将优化的基因构建在带有信号肽的载体p PIC9K上,然后将其转入毕赤酵母菌株GS115中。用Western Blot检测阳性菌株的蛋白表达情况。结果显示,酵母工程菌在温度28.5℃、转速220 rpm、诱导培养基甲醇添加量为1%的条件下诱导70h可以表达杜仲β-1,4-葡聚糖酶。3、杜仲β-1,4-葡聚糖酶的表达及纯化通过检测发现目标蛋白的分子量为130-250 KDa之间,而所预测的分子量为60 KDa,说明所表达蛋白可能以多聚体形式出现,并且SDS-PAGE和Western Blot图显示所表达蛋白有很强的糖基化。此结果与此酶在天然条件下为多聚体并且有很强的糖基化特点相符。蛋白质谱结果显示共鉴定到了24条多肽,蛋白质序列覆盖率达到67%。结合以目标蛋白融合的6X His标签为抗原进行蛋白免疫印迹,通过特异性抗体检测出蛋白条带的表达情况,表明表达出来的蛋白是目标蛋白。对毕赤酵母工程菌分泌表达β-1,4-葡聚糖酶发酵条件进行优化。结果表明,诱导96 h后即可终止发酵;诱导初始p H最佳值为6;诱导温度最佳值为28℃;最佳甲醇添加量为1.5%。在最优发酵条件下对毕赤酵母工程菌诱导表达β-1,4-葡聚糖酶进行30 L发酵培养。粗酶液用Ni-NTA进行蛋白分离纯化。纯化后蛋白SDS-PAGE结果显示蛋白条带单一。结合以目标蛋白融合的6XHis标签为抗原进行蛋白免疫印迹,通过特异性抗体检测出蛋白条带的表达情况,表明纯化的蛋白即是目标蛋白。目标蛋白酶活为286.35 U/ml。对30 L发酵液纯化得到的目标蛋白进行蛋白冻干,共得到29.46 g蛋白粉末。4、β-1,4-葡聚糖酶在杜仲嫁接中的应用有研究表明,β-1,4-葡聚糖酶有助于嫁接植物砧木和接穗细胞融合,从而提高嫁接的存活率。本研究将发酵产生的β-1,4-葡聚糖酶应用于杜仲嫁接,为了进行对照同时也将商品化β-葡聚糖酶（β-1,3-葡聚糖酶和β-1,4-葡聚糖酶混合物）用于杜仲嫁接。结果显示,与对照组相比,实验的酶浓度都能提高杜仲嫁接的成活率,其中在最高发芽率的情况下,所用的杜仲β-1,4-葡聚糖酶浓度低于β-葡聚糖酶浓度。