论文部分内容阅读
百合(Lilium spp.)作为全球著名的切花商品花卉,花色一直是其重要的观赏品质之一。通过传统育种的方法,百合已经培育出除蓝紫色系以外的几乎所有色系。但在通过基因修饰改变植株颜色受到普遍关注的今天,百合转基因工程仍处于初步阶段。因此,本论文以从金鱼草中克隆的花青素合成调节基因Del/Ros1为目的基因,研究了根癌农杆菌对东方百合杂种系品种‘索邦’遗传转化的影响因素,建立了高效的百合遗传转化体系;同时对基因枪法和花粉管通道法进行了探讨;通过分子检测,目前已得到转基因植株。主要研究成果如下:
1.优化了‘索邦’无菌受体系统:最适的再分化培养基配方为MS+NAA0.2 mg· L-1+ TDZ0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1,不定芽诱导率达93.3%;鳞茎增大培养基为MS+蔗糖60 g·L1+活性炭1 mg·L-1,鳞茎直径平均可增大226.6%;细菌污染苗的最佳处理方式为将鳞茎浸入含Carb500 mg·L-1的无菌水中振荡洗涤10 min,再转入MS+蔗糖30 g·L-1+ Carb500 mg·L-1的培养基中,15d左右继代一次,继代5-6代后细菌可完全去除。
2.利用农杆菌介导法将花青素合成调节基因Del/Ros1导入‘索邦’,并对转化体系进行优化。结果表明,‘索邦’试管苗鳞片经过1d预培养、侵染液及共培养基中加入50μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)、共培养基中去除NH4NO3并将pH值调至5.5,有利于提高抗性芽率。
3.通过农杆菌途径对比了不同启动子控制的Del/R os1基因对‘索邦’的转化情况,结果显示组织特异性启动子的抗性芽率均要高于组成型启动子,其中以根部特异性启动子的的抗性芽率最高,为44.1%。2×CaMV35S、Pcre启动子转化后的不定芽在整体颜色上较AP3、Root启动子的深,部分不定芽甚至带有浅紫色。
4.用2×CaMV35S启动子控制的Del/Ros1基因对比了农杆菌、基因枪、花粉管三种转化方式的效率,以农杆菌转化途径获得的抗性芽率最高,为20.7%,基因枪为2.78%,花粉管的抗性芽率最低,仅为0.22%。
5.通过PCR以及Southern blot检测,最终获得4株转基因植株,其中农杆菌介导的3株,基因枪介导的1株,花粉管通道法0株,转化率分别为0.37%、0.28%和0%。但生根后的转基因植株颜色与对照相比并未发生明显变化。