背景和目的：　　免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗之后第四大肿瘤治疗方法，主要包括肿瘤疫苗，CAR-T，TCR-T，免疫检查点抑制剂等[1]。CD8+T细胞作为主要的抗肿瘤免疫细胞，在肿瘤抗原的刺激下激活产生IFN-γ，GranzymeB，IL-2等细胞因子杀伤肿瘤细胞。但在其活化过程中可产生CTLA-4，PD-1等免疫检查点，上调的免疫检查点在与其配体结合后可明显抑制CD8+T细胞功能[2]。且肿瘤细胞分泌的TGF-β也可以显著上调PD-1的表达，引起免疫逃逸。在此研究基础上以PD-1为靶点的免疫检查点抑制剂取得了巨大的成功。然而并不是所有的病人都对该抑制剂产生有效的免疫应答。因此探索PD-1产生新的机制，抑制PD-1的表达显得尤为重要。　　Notch分子是广泛存在于多种细胞表面的跨膜蛋白分子，主要存在4种类型Notch受体(Notch1-4)和5种Notch配体（Delta-like1，3，4，Jagged1和Jagged2）。其中Notch1的研究最为广泛，其配体和受体结合后可以激活胞内信号通路，胞内域剪切形成胞内段(NICD)，继而NICD和RBP-JK结合形成蛋白复合体，进入胞核作为转录因子调控下游基因的表达[3，4]。Notch1在肿瘤中异常激活可促进肿瘤的发生，发展。对肿瘤的生长，代谢，周期都起到重要的调控作用。在T细胞中Notch1信号通路的研究主要集中在CD4+T细胞包括CD4+T细胞的分化，增殖等[5，6]。而在CD8+T细胞中Notch1也已有很多研究，如促进CD8+T细胞向终效应性T细胞分化，促进CD8+T细胞的功能等[7]，也有研究发现Notch1促进CD8+T细胞表面PD-1的表达，但具体机制还有待进一步研究。　　既往研究表明多种信号通路、转录因子以及表观修饰等机制都参与了PD-1的形成过程[8，9]。长链非编码RNA是一类长度为大于200bp的调节性RNA，虽然不具有编码蛋白质的能力，但其在表观遗传、转录及转录后调控等多个层面对基因的表达进行调控，如X染色体沉默[10]、基因组印记以及染色体修饰[11]、转录激活、转录干扰、核内运输.通过转录或转录后修饰参与了多种免疫细胞的生物进程[12，13]，包括CD4+T细胞的分化[14]，DCs的成熟[15]，巨噬细胞的极化[16].等细胞的生长、增殖、分化以及凋亡等各种生理活动[17，18]，与人类疾病的发生发展及诊断治疗都有着密切联系。miRNA也是一类内源单链调节性RNA，约18-24个核酸长度。主要通过和靶基因的3UTR区结合来降解靶基因的表达。预计约90％的mRNA都受到miRNA的调控[19]。研究发现miRNA也参与了CD8+T细胞的分化，如miR-17-92通过作用于PTEN来调节PT3K-Akt-mTOR信号通路，从而介导效应和记忆性CD8+T细胞的分化发育[20]。miR-28通过分别结合到PD-1，TIM-3和BTLA的3UTR区域来下调该免疫抑制性分子的表达。进而逆转T细胞的耗竭过程[21]。非编码RNA在T细胞的各种生物进程中都起到了重要的调控作用，但是长链非编码RNA对CD8+T细胞表面PD-1的表达是否有调控作用尚无研究报道。因此，本课题旨在研究长链非编码RNA对CD8+T细胞表面PD-1表达的调控作用，探讨PD-1表达的新机制，为免疫检查点治疗提供新的理论依据。　　方法：　　血站收取健康志愿者外周血白膜层，密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC)，免疫磁珠细胞分选法获取CD8+T细胞，利用CD3/CD28活化微珠激活CD8+T细胞，72小时后采用流式术检测PD-1的表达，并分选PD-1高表和低表两群CD8+T细胞，后提取RNA进行lncRNA和mRNA测序分析。在高表和低表两群中选取差异较大的差异基因利用RT-PCR进行验证，最终确定可能调控PD-1表达的lnc-26915，荧光原位杂交检测lnc-26915在CD8+T细胞中的亚定位，敲除lnc-26915后RT-PCR和流式细胞术检测PD-1的表达，构建过表达PD-L1的A549细胞系，和CD8+T细胞共孵育，流式细胞术检测CD8+T细胞功能性细胞因子，CD8+T细胞转染miRNA的mimics后，RT-PCR检测lnc-26915的表达，RT-PCR和流式细胞术检测PD-1的表达，流式细胞术分选活化后PD-1高表和PD-1低表的两群细胞，western检测Notch1信号通路的表达情况，双荧光素酶报告实验用于检测lnc-26915与PD-1竞争性结合miRNA，Chip实验用于研究Notch1信号通路对PD-1和lnc-26915的直接调控作用。　　结果：　　1.RT-PCR结果显示，在高表PD-1的CD8+T细胞中lnc-26915的表达较高，且随活化时间的不同和PD-1表达变化呈正相关。　　2.FISH实验结果表明，lnc-26915主要位于胞质中，提示lnc-26915可能通过和miRNA相互作用来调控PD-1的表达。　　3.转染si-lnc-26915和miR-3619-5pmimics结果表明，敲低lnc-26915和过表达miR-3619-5p均可以降低PD-1的表达。　　4.流式分析结果表明，敲低lnc-26915和过表达miR-3619-5p后PD-1表达降低，且和过表达PD-L1的293T细胞共孵育后，CD8+T细胞的功能性细胞因子表达降低。　　5.双荧光实验表明，miR-3619-5p可与lnc-26915和PD-1的3UTR区结合，降低lnc-26915和PD-1的表达。　　6.Wester实验表明，在PD-1高表的CD8+T细胞中Notch1表达较高。　　7.RT-PCT结果表明，抑制剂抑制Notch1信号通路后lnc-26915和PDCD1的表达均下降。　　8.Chip实验表明，Notch1不能直接通过和PD-1的启动子区结合来促进PD-1的转录，Notch1可通过和lnc-26915的启动子区结合来促进其转录。　　结论：　　1.在CD8+T细胞活化过程中，lnc-26915可以通过竞争性结合miR-3619-5p来促进PD-1的表达。　　2.在CD8+T细胞中，miR-3619-5p可以通过靶向结合lnc-26915和PDCD1来抑制二者的表达。　　3.Notch1可以通过和lnc-26915的启动子结合区来促进lnc-26915的转录。