2017年，美国FDA先后批准上市两款嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cells，CAR-T)产品。原本中位生存时间不足半年的极端难治性复发性白血病和淋巴瘤患者，接受CD19为靶点的CAR-T细胞治疗后，完全缓解率高达50%-80%。CAR-T技术由此开启了肿瘤免疫治疗的新时代，并有望成为人类攻克自身免疫性疾病、病毒感染性疾病等多种疾病的重要手段。但与常规小分子化药或抗体类大分子生物药不同，CAR-T细胞取材于人体原代细胞，经体外基因修饰和扩增培养后回输患者，是一类崭新的细胞治疗药物。为获得高质量的CAR-T细胞以提高临床疗效，不断优化CAR-T细胞的基因修饰方法，并建立准确评估CAR-T细胞肿瘤杀伤能力的检测方法，就显得尤为重要。
　　目的：
　　本研究开展了两方面的工作。第一，针对慢病毒转导原代T淋巴细胞的技术难点，对多项关键实验参数进行优化，以实现CAR分子的高效表达。第二，针对现有文献方法存在“非特异性杀伤”的现象，采用基因编辑方法，分别敲除HLA分子与CD19分子，构建四种靶细胞，探索“非特异性杀伤”的发生机制，改进杀伤活性计算方法，建立并优化CAR-T细胞杀伤活性的检测评估方法。
　　方法：
　　第一部分：CAR-T细胞的制备与优化
　　1.探索慢病毒LV_CAR19最佳转导量；
　　2.比较T细胞不同活化方式对LV_CAR19转导效率影响；
　　3.探索T细胞活化后LV_CAR19最佳转导时间；
　　4.比较不同促转导试剂对LV_CAR19转导效率的影响；
　　5.观察LV_CAR19转导后的洗涤是否可以提高转导效率。
　　第二部分：靶细胞的构建及鉴定
　　1.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和磁珠分选的方法，制备Namalwa（HLA+\CD19+）、Namalwa（HLA-\CD19+）、Namalwa（HLA+\CD19-）、Namalwa（HLA-\CD19-）四种不同基因敲除类型的细胞；
　　2.观察不同基因敲除的Namalwa细胞EGFP荧光表达水平变化；
　　3.观察不同基因敲除的Namalwa细胞荧光素酶活性变化；
　　4.观察不同基因敲除的Namalwa细胞增殖活性变化。
　　第三部分：CAR-T细胞体外杀伤检测体系建立与优化
　　1.评估CAR-T细胞现有体外杀伤检测体系；
　　2.优化CAR-T细胞体外杀伤检测体系；
　　3.评估优化后的CAR-T体外杀伤检测体系；
　　4.利用优化后的体系，检测新制备的CAR-T体外杀伤能力。
　　结果：
　　第一部分：CAR-T细胞的制备与优化
　　优化的慢病毒LV_CAR19转导T细胞方案为：OKT3活化T细胞12 h后，按照MOI为40加入LV_CAR19进行转导，转导同时加入促转导试剂Polybrene。最终可获得CAR19表达效率高于50%的CD19.CAR-T细胞。
　　第二部分：靶细胞的构建及鉴定
　　1.成功制备Namalwa（HLA+\CD19+）、Namalwa（HLA-\CD19+）、Namalwa（HLA+\CD19-）、Namalwa（HLA-\CD19-）四种不同基因敲除细胞;
　　2.四种不同基因敲除Namalwa细胞在EGFP荧光表达水平、荧光素酶活性以及细胞增殖活性上无明显区别。
　　第三部分：CAR-T体外杀伤检测体系建立与优化
　　1.发现现有CAR-T杀伤检测体系存在杀伤能力高估以及T细胞“非特异性杀伤”的现象；
　　2.效应细胞抑制靶细胞增殖和HLA增强CD19.CAR-T杀伤能力是导致现有检测体系检测不准确的原因；
　　3.通过引入新的靶细胞、优化对照组设置及杀伤计算方式，成功解决现有检测体系存在的不足问题，建立的新检测体系提高了CAR-T细胞体外杀伤检测的准确性。
　　结论：
　　通过转导条件优化，成功提高了LV_CAR19转导T细胞效率，CAR19在T细胞上的表达效率超过50%。成功建立及优化一套新的CAR-T细胞体外杀伤检测体系，提高了CAR-T杀伤检测准确性。