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硫酸软骨素(CS)和硫酸皮肤素(DS)都是线性阴离子粘多糖,广泛存在于细胞表面、细胞基质和结缔组织中。在生物体内CS和DS常交替存在(CS/DS),不仅是重要的结构物质,还具有一系列重要生物学功能。这是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定受体蛋白的相互作用实现的。越来越多的研究表明,CS/DS的硫酸化模式在其各种生物学功能中发挥了关键作用。CS/DS硫酸酯酶(Sulfatase)是一类专一性水解去除糖链中特定部位硫酸基团的酶,其蛋白质序列具有一定保守性,可分为外切型和内切型硫酸酯酶。外切酶只对CS/DS糖链末端的硫酸基团具有脱去作用,而内切型硫酸酯酶对糖链末端和内部的硫酸基团均有脱去作用。因此,内切型CS/DS硫酸酯酶不仅可用于制备结构均一的CS/DS多糖或寡糖,也是分析糖链结构和功能的重要工具,对相关疾病的研究和治疗具有重要价值。最近,本课题组报道了一种来自海洋细菌Vibrio sp. FC509的新型内切型CS/DS硫酸酯酶(4-O-endosulfatase),这是从海洋微生物中发现的首个糖胺聚糖硫酸酯酶。该酶能以多种CS/DS糖链为底物,专一性降解4-位硫酸基团,效率为17-65%。但是,该酶的脱硫酸基模式尚不完全清楚。因此,本论文制备了一系列不同硫酸化模式的CS六糖,并分析了结构特征,用重组酶4-o-endosulfatase与结构明确的六糖和八糖分别进行反应,初步地分析了酶的作用模式。具体如下：1.不同硫酸化模式CS六糖的制备：用HCLase部分降解CS-A和CS-E多糖,通过凝胶过滤层析制备二糖到十二糖；用阴离子交换柱YMC-Pack PolyamineⅡ对取所得的CS-A和CS-E六糖进行亚分级,以获得硫酸化模式不同的六糖；最后,用阴离子柱YMC-Pack PA-G所得的六糖组分进行纯化,将纯化所得六糖进行2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记,用HPLC分析纯度,得到十四个高纯的六糖。2.不同硫酸化模式六糖的结构分析：将纯化所得十四种六糖纯品分别与过量的CSase ABC反应,然后用2-AB标记寡糖产物,最后通过HPLC分析每种六糖的二糖组成特征；将2-AB标记的每种六糖用CSase ABC降解,产物二次标记,最后通过HPLC分析其非还原端结构；将2-AB标记的每种六糖用HCDase降解,通过HPLC分析其还原端的二糖结构。根据上述结果,确定了所得十四种六糖的糖链序列信息,其中硫酸化模式特异且结构均一的CS六糖有十三种。3.4-O-endosulfatase的作用模式研究：1)4-O-endosulfatase与硫酸化模式不同的六糖或八糖进行作用,发现：不论HexUA1-3GalNAc(4S)位于六糖糖链的非还原端、还原端或内部,该糖单元中的4-位硫酸基团均能被彻底脱去；然而,无论二硫酸化的HexUA1-3GalNAc(4S,6S)位于六糖链的非还原端或内部,其4-位硫酸基团均不能脱去；当4-O-endosulfatase与八糖△4,5HexUAα1-3GalNAc(6S) β1-4GlcAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(2S)β1-3GalNAc(6S)β1-4GlcAβ1-3GalNAc(6S)作用时,4-位硫酸基团不能脱去,提示HexUA(2S)1-3GalNAc(6S)的存在能抑制酶的活性。2)用4-O-endosulfatase对结构为△4,5HexUAα1-3GalNAc(4S) β1-4GlcAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcAβ1-3GalNAc(4S)的六糖进行处理,隔时取样,分析产物的脱硫酸基情况,发现产物所含硫酸基团随时间延长逐步减少,直至被完全去除；对其中脱去单个硫酸基团的中间产物进行糖链分析,发现其还原端二糖单元不含硫酸根,这提示该酶从糖链的还原端开始、依次向非还原端脱去4-位硫酸基团。综上,本论文用凝胶过滤层析和离子交换层析制备了十三种硫酸化模式特异且结构均一的CS六糖,用酶法测定了糖链序列,并以糖链序列确定的六糖和八糖为底物分别与酶进行作用,初步揭示了4-O-endosulfatase的作用模式,这为CS/DS复杂的构效关系研究,以及酶法制备结构均一的寡糖或多糖奠定了坚实的酶学基础。