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【背景】慢性便秘(chronic constipation,CC)是全球范围内常见的胃肠功能障碍性疾病,严重影响人们身心健康和生活质量。近期数据显示,我国8.2%的人群受便秘困扰(约1亿人),男女比例约为1:2.3,育龄期和妊娠期妇女发病率更高。动物实验发现雌激素可抑制大鼠结肠运动,致便秘发生。肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)的磷酸化水平是决定平滑肌收缩程度的关键因素。MLC磷酸化的水平受钙离子/钙调蛋白依赖的肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)和钙离子非依赖的肌球蛋白磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)的双重调节。RhoA/ROCK通路是调控MLCP活性的主要通路之一(钙敏化机制)。ROCK一方面可以直接磷酸化MLCP的调节亚基MYPT1,使MLCP失去活性,从而不能使磷酸化的MLC去磷酸化,导致细胞内磷酸化的MLC增多,平滑肌收缩增强;另一方面可以通过使一种平滑肌特异性磷蛋白CPI17磷酸化,导致其构象改变,从而间接抑制MLCP的活性,致平滑肌收缩增强。研究发现雌激素可抑制冠脉、膀胱、尿道、血管等平滑肌中RhoA/ROCK通路表达。本课题拟探讨RhoA/ROCK通路在雌二醇抑制大鼠结肠平滑肌收缩中的作用,为治疗雌激素相关性便秘等胃肠动力障碍性疾病提供新的靶点。【目的】1、探讨RhoA/ROCK通路在17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)影响大鼠结肠平滑肌中的作用。2、探讨17β-雌二醇影响大鼠结肠平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)中RhoA/ROCK通路的机制。【方法】1、动物实验(1)雌性SD大鼠,手术去除双侧卵巢,并随机分为:对照组、17β-雌二醇(E2)组、雌激素受体抑制剂(ICI 182780)组和BSA-E2组。每组大鼠皮下分别埋置硅胶管,其中对照组含空白溶剂;E2组内含0.3mg/m L的E2,保持大鼠血清雌激素在生理浓度(56-92 pg/m L);雌激素受体抑制剂(EI)组内含相同浓度的E2及E2受体抑制剂(ICI 182780);BSA-E2组内含BSA-E2(不能通过细胞膜,仅发挥非基因组作用)。(2)干预14天后处死大鼠,取大鼠结肠肌条,MPA分析系统检测各组大鼠肌条收缩强度;免疫荧光、Western Blot及反转录实时荧光定量(q RT)-PCR检测各组大鼠肌条中RhoA/ROCK通路相关分子的分布及表达。2、细胞实验(1)检测ROCK1及雌激素受体(estrogen response,ER)在大鼠结肠SMCs中的表达:免疫荧光双标法观察ROCK1、ER分别与α-肌动蛋白(α-SMA)共表达。(2)检测E2对RhoA/ROCK通路表达的影响:(1)不同浓度和不同时间E2刺激后,以(q RT)-PCR、Western Blot印迹检测RhoA、ROCK1的蛋白及m RNA表达。(2)不同浓度ROCK抑制剂Y27632处理后,Western Blot印迹检测E2刺激下ROCK1及下游蛋白表达。(3)检测影响RhoA/ROCK通路的E2受体类型:(1)大鼠结肠SMCs分为溶剂(DMSO)组、E2组、雌激素α受体激动剂(PPT)组、雌激素β受体激动剂(DPN)组、雌激素受体抑制剂(EI)组、BSA-E2组,(q RT)-PCR、Western Blot印迹检测RhoA、ROCK1的蛋白及m RNA表达;(2)构建ERα、ERβ的si RNA,并转染大鼠结肠SMCs,E2刺激后,以(q RT)-PCR、Western Blot印迹检测RhoA、ROCK1的蛋白及m RNA表达。【结果】1、各组大鼠肌条收缩强度:雌激素组结肠平滑肌收缩力明显低于其他各组(P<0.05);雌激素受体抑制剂(EI)组、BSA-E2组与对照组差别无统计学意义。2、各组大鼠结肠肌条中RhoA、ROCK1分布及表达:雌激素组RhoA、ROCK1蛋白及m RNA表达均显著低于其他各组(P<0.05);雌激素受体抑制剂(EI)组、BSA-E2组与对照组差别无统计学意义。3、细胞免疫荧光显示ROCK1和雌激素受体分别与α-肌动蛋白共表达。4、E2可抑制结肠SMCs中RhoA、ROCK1 m RNA及蛋白表达,50 nmol/L为最适浓度(P<0.05),24h为最适时间(P<0.05);ROCK抑制剂Y27632可呈浓度依赖性抑制下游蛋白p-MYPT1、p-CPI17、p-MLC的表达。5、雌激素α受体激动剂(PPT)可显著下调RhoA、ROCK1 m RNA及蛋白的表达(P<0.05),而雌激素β受体激动剂(DPN)及BSA-E2对RhoA、ROCK1的表达无明显影响;雌激素α受体si RNA干扰后,E2可上调RhoA、ROCK1的表达。【结论】1、雌激素可抑制大鼠结肠平滑肌收缩力及结肠平滑肌中RhoA/ROCK通路相关分子的表达。2、雌激素能抑制大鼠结肠SMCs中RhoA/ROCK通路,该作用由雌激素α受体介导。