背景:随着时代的不断发展,心理健康问题越来越引起人们的重视。社会隔离是应激的一种类型,长期处于社会隔离状态可以导致各个年龄阶段人类和动物的行为异常以及脑神经活动异常。孤养即单笼隔离饲养小鼠是研究社会隔离的经典模型。大量研究表明,孤养模型动物伴随有内分泌、免疫和神经等多个系统的失调和功能变化。同时,长期孤养也可以引起脑发育异常及认知功能障碍,涉及的脑区包括前额叶皮层、基底外侧杏仁核、海马等。也有研究表明,孤养对小鼠神经元突触可塑性有负面影响。然而,以往研究多是探讨孤养小鼠的行为和生理变化,在细胞层面记录神经元群体自发放电活动及模式的研究很少。前联合皮层(Frontal association cortex,FrA)也称前额叶联合皮层,参与多种高级脑功能,被认为是信息传递的枢纽。作为信息整合脑区,FrA接收大量感觉皮层和控制情绪的深部核团的神经纤维投射,如内侧前额叶皮层、脑岛、前扣带回和杏仁核等。而前额叶皮层(Prefrontal cortex,PFC)被认为控制自上而下的认知加工和调控功能,其结构、功能异常被认为是介导个体产生应激反应的重要原因。扣带回、杏仁核被认为控制自下而上的负性情绪加工。因此,同时接收前额叶皮层和杏仁核神经纤维投射的FrA可能是整合两脑区信息的重要环节,其功能与负性情绪和异常行为的加工有关。脑区内神经网络的细胞自发活动水平常作为研究异常与正常个体的重要指标,使用双光子钙成像技术对孤养小鼠前联合皮层细胞自发放电活动的记录可以帮助我们理解孤养对小鼠造成的神经放电模式变化。研究假设:对小鼠进行长时间孤养会导致其出现行为表现异常,包括自主活动的增加、抑郁症状和社交行为异常等。这种行为的异常变化与负性情绪和认知加工相关。根据前人研究,前联合皮层与负性情绪加工有紧密关系。通过对前联合皮层的在体双光子成像,记录孤养小鼠和群养小鼠皮层神经元自发放电情况,对细胞放电频率进行分析,得到结果。研究认为孤养应激刺激增加小鼠前联合皮层神经元群体放电频率,其放电模式也可能存在改变。最后研究对前联合皮层其进行荧光环路示踪,找到相关神经投射,推测可能与前联合皮层神经元形成联结的神经环路。实验目的:(1)通过对小鼠孤养建模后的行为学测试,发现其在情绪和记忆上的异常行为;(2)对孤养小鼠前联合皮层群体神经元自发放电活动进行记录,和群养小鼠比较细胞自发放电模式的差异;(3)找到与前联合皮层相关的投射脑区,为环路构建做铺垫。总而言之,本研究将从行为学和神经元层面揭示孤养的社会应激对小鼠造成的影响,并找到前联合皮层的环路连接。实验方法:实验一对成年雄性小鼠进行孤养建模并对其进行行为学测试。随机选取出生后8周的健康C57BL/6J雄性小鼠16只,将其随机分为两组,即群养组和孤养组。群养组四只一笼,孤养组单只一笼,对两组动物进行为期30天的饲养,从而建立孤养动物模型。30天后,对小鼠进行行为学测试,行为学测试涵盖了对小鼠自发行为、异常情绪行为及社交行为等方面的测试。包括旷场实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫实验、悬尾实验、糖水实验和社交实验。根据小鼠在不同实验中的行为表现,推测孤养对小鼠在焦虑、抑郁及社交方面的影响。实验二使用双光子钙成像技术分别记录孤养和群养活体小鼠在FrA的放电情况。实验分为开颅手术、群体细胞钙染料标记、双光子成像和记录、获得小鼠脑组织样本、形态学切片等步骤。在将孤养小鼠麻醉后,对FrA脑区定位并进行开颅手术,随后使用局部注射荧光钙染料的方法在显微镜下找到注射点注射Cal-520AM染料对脑内的神经元进行标记。随后,在双光子显微镜下进行神经元自发放电活动的记录。群养小鼠步骤同上。记录完成后,使用LabVIEW软件对采集到的数据进行分析。关注指标为细胞群体标记脑区的准确性及两组别神经元自发放电频率及模式的不同。实验三使用神经标记物对FrA脑区神经元进行顺行或逆行环路示踪。实验使用逆行和顺行示踪的两种荧光标记物,CTB488和Mini-ruby。通过立体定位局部注射的方法,将FrA的神经元进行荧光标记,随着染料在脑区神经元内的扩散,来顺行或逆行追踪到与FrA脑区存在神经纤维连接的其他脑区。待标记物充分表达后,对小鼠进行形态学切片,使用共聚焦显微镜拍摄脑片,得到投射结果。结果:实验一结果表明孤养小鼠在旷场实验中表现出一定的行为异常,主要表现为穿越旷场中心的速度显著高于群养组小鼠(p=0.042,n=8);在强迫游泳实验中表现出更多的僵直、放弃挣扎行为(p=0.002,n=8);在社交实验中,孤养小鼠无论在面对物体或面对新奇小鼠时均未表现出偏好性,而群养小鼠表现出了对同类陌生小鼠的显著偏好性,这代表小鼠在孤养后社交能力受损。综上所述,实验一的行为学检测中,孤养小鼠表现出了轻微焦虑样、抑郁样行为,其社交能力也伴随有损伤。实验二结果表明,在孤养小鼠中,FrA脑区的神经元放电频率高于群养小鼠。两组别在频率分布上有显著性差别。经统计,在孤养小鼠中,细胞活跃比为44%,群养小鼠的细胞活跃比36%,孤养小鼠FrA的活跃细胞比例高于群养组。在孤养小鼠FrA提取单个神经元钙信号后,我们发现其中有连续高频发放的信号存在,提示FrA神经放电活动与群养组相比发生了变化。实验三结果表明,FrA接收来自对侧FrA和屏状核的神经元投射,FrA的神经元胞体则投射到尾状核、基底杏仁核、大脑脚和黑质等区域。这与实验的最初假设相同,FrA有可能是处理与情绪加工相关行为的信息整合中心。结论:孤养对小鼠而言是一种温和的慢性应激刺激,长期处于孤养条件下不利于小鼠的情绪及社交行为,孤养小鼠表现出一定的焦虑和抑郁症状且伴随有社交能力的损伤。在孤养小鼠的前联合皮层中,神经元表现出自发放电频率的增加,提示前联合皮层细胞异常放电可能与小鼠的行为异常相关。经过对前联合皮层的环路示踪发现,其与多个脑区包括情感处理中心基底杏仁核之间存在环路连结,提示前联合皮层可能是处理有关情绪异常行为的信息整合中心。