脑卒中是全球成人致残的首位因素,在我国已经超越癌症成为第一位的致死性疾病。众所周知,神经元对缺血及变性等损伤极为敏感且一旦发生损伤或坏死就难以自身修复再生,损伤所致的神经细胞死亡是缺血性脑卒中和神经变性疾病致残率居高不下的根本原因。但目前国际上尚无有效的针对神经损伤和坏死发挥直接修复作用的药物或干预措施。在不同类型的急性脑损伤中,自噬发挥不同的作用。现有观点认为,自噬在精神药物所致的毒性损伤、蛛网膜下腔出血和脊柱损伤中起着神经保护作用;在新生儿缺血缺氧损害中,自噬性细胞死亡则造成神经元的死亡。然而自噬在脑卒中损伤中发挥怎样的作用目前尚不清楚。既往研究大多集中在调控神经元自噬流水平在急性脑损伤中发挥的作用,对星形胶质细胞自噬流在急性脑损伤中的作用认识尚缺。哺乳动物中枢神经系统中,星形胶质细胞占所有胶质细胞的大多数,在维持血脑屏障和调控局部脑血流方面发挥重要作用,同时还可以通过释放营养因子、抗氧化因子向神经元提供代谢支持,在神经递质循环、调控突触可塑性和突触传递方面也发挥重要作用。神经元可以释放损伤的线粒体并将其转运入星形胶质细胞中,最新的研究证明,脑缺血过程中星形胶质细胞可以向神经元提供有功能的线粒体,从而提高缺血损伤后神经元的存活。提示,神经元-星形胶质细胞之间的物质转运可能是卒中后机体重要的内源性保护机制。那么,调控星形胶质细胞的自噬流水平是否也能提高神经元在脑卒中后的存活呢?目前尚未见研究。本研究旨在探索调控星形胶质细胞自噬流水平对氧糖剥夺/复糖复氧以及脑缺血再灌注后神经元存活的影响,从而发挥脑保护作用。实验一原代神经元和星形胶质细胞OGD后自噬流的时程变化【目的】研究原代神经元和星形胶质细胞在OGD/复糖复氧过程中自噬流水平变化规律。【方法】1、分别培养原代神经元和星形胶质细胞,将神经元和星形胶质细胞随机分为6组:Sham组,OGD 1 h/复糖复氧(0 h,6 h,12 h,24 h,48 h)组;另将星形胶质细胞分为6组:Sham组,OGD 4 h/复糖复氧(0 h,6 h,12 h,24 h,48 h)组;使用Western Blot的方法检测自噬流的标记蛋白LC3、p62的表达;使用透射电镜观察每组神经元的自噬小体、自噬溶酶体的数量。此外,将神经元与星形胶质细胞随机分为2组:雷帕霉素处理组和对照组。使用Western Blot检测各组细胞自噬流的标记蛋白的表达,对各组细胞分别感染m RFP-GFP-LC3慢病毒,待病毒感染稳定后,通过荧光观察神经元和星形胶质细胞的自噬流水平。【结果】1、神经元自噬流在正常状态下处于较低水平,OGD后即刻自噬水平上调(P<0.05),在复糖复氧12 h时自噬流抑制,降到基础水平,随后自噬流被重新上调,在复糖复氧24 h以及48 h升高(P<0.05)。雷帕霉素处理后,神经元自噬流升高(P<0.01)。2、星形胶质细胞自噬流在正常状态下处于较高水平,OGD 1 h对星形胶质细胞自噬流影响不大,OGD 4 h/复糖复氧后自噬流水平开始下降,在复糖复氧12 h时降到最低(P<0.05),随后自噬上调,在24 h以及48 h自噬流再次升高,几乎和基础状态下一致。雷帕霉素处理后,星形胶质细胞自噬流升高(P<0.01)。【结论】1、OGD后神经元自噬流水平处于波动状态,在复糖复氧即刻自噬水平迅速上调,而在6 h以及12 h时降低,在复糖复氧24 h自噬水平重新上调。2、OGD后星形胶质细胞自噬流水平处于波动状态,在复糖复氧后自噬水平逐渐下降,并在12 h时降到最低低,在复糖复氧24 h自噬水平重新上调为正常状态水平。实验二星形胶质细胞对神经元应对OGD损伤能力的影响【目的】观察星形胶质细胞与神经元共培养相比神经元单独培养,神经元应对OGD损伤能力有无改变。【方法】单独培养原代神经元,将神经元分为4组:Sham组,OGD(15 min,30 min,60 min)/R(24 h)组;单独培养星形胶质细胞,将星形胶质细胞分为2组:Sham组,OGD 1 h/R(24 h)组,分别观察各组神经元和星形胶质细胞的活力。随后,将神经元与星形胶质细胞进行间接共培养,并分为2组:Sham组,OGD 1 h/R(24 h),检测共培养下的神经元的细胞活力。【结果】原代神经元在OGD 60 min复糖复氧24小时处理后,其细胞活力相比对照组降低至65%左右(P<0.001),而星形胶质细胞OGD处理后其细胞活力与对照组无明显差异;共培养下的神经元OGD处理后其细胞活力相比对照组下降至80%(P<0.01),共培养神经元的活力明显高于单独培养下的神经元。【结论】神经元易受缺血缺氧打击,而星形胶质细胞耐受缺血缺氧打击的能力较强,星形胶质细胞增强了神经元应对OGD损伤的能力。实验三调控星形胶质细胞自噬流水平对其自身应对OGD损伤的影响【目的】分别上调或下调星形胶质细胞自噬流水平,随后给予OGD 4 h/复糖复氧24h,观察星形胶质细胞在不同的自噬流水平下应对OGD损伤的能力。【方法】培养原代星形胶质细胞,将星形胶质细胞分为5组:Sham组,Ctrl组、雷帕霉素(RAPA)处理组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、小干扰RNA靶向自噬相关基因7(si ATG7)组,以上调或下调星形胶质细胞自噬流水平,后四组给予OGD 4 h复糖复氧24 h,观察各组星形胶质细胞在不同的自噬流水平下应对OGD损伤的能力有无改变。【结果】在基因水平上干扰自噬相关基因ATG7的表达降低了星形胶质细胞应对OGD损伤的能力(P<0.001);上调星形胶质细胞自噬流水平有增加星形胶质细胞应对OGD损伤能力的趋势(P=0.0553),然而并没有统计学差异。【结论】抑制星形胶质细胞自噬流水平降低其应对OGD损伤的能力,意味着星形胶质自噬对其自身功能的维持发挥着重要作用。实验四调节星形胶质细胞自噬流水平对神经元在正常状态以及OGD后存活的影响【目的】研究调控星形胶质细胞自噬流水平后对神经元存活的影响。【方法】1、培养原代星形胶质细胞,将星形胶质细胞分为4组:对照组,RAPA处理组,3-MA处理组,si ATG5处理组以上调或下调星形胶质细胞自噬流水平,随后将各组的星形胶质细胞与神经元进行间接共培养并分别给予Sham和OGD(1 h)复糖复氧24 h处理,观察各组神经元的凋亡、细胞活力并检测共培养体系中LDH的释放量。【结果】1、在正常情况下调控星形胶质细胞自噬流水平对神经元的凋亡、存活以及共培养体系中LDH的释放无影响。2、OGD情况下上调星形胶质细胞自噬流减少神经元的凋亡(P<0.01),增强神经元活力(P<0.01),减少共培养体系中的LDH释放量(P<0.05),而抑制星形胶质细胞增加神经元的凋亡(P<0.05,P<0.01),降低神经元活力(P<0.05,P<0.001),增加共培养体系中的LDH释放量(P<0.05)。【结论】1、在正常情况下调控星形胶质细胞自噬流水平对神经元无显著性影响。2、OGD损伤后上调星形胶质细胞自噬流水平能够增加神经元的存活,发挥了细胞保护作用,而抑制星形胶质细胞自噬流水平可降低神经元的存活发挥细胞毒性作用。实验五在体调控星形胶质细胞自噬流水平对脑缺血再灌注后脑梗塞范围和神经元存活的影响【目的】研究调控星形胶质细胞自噬流水平对小鼠MCAO1 h/R 24 h后脑梗死范围和神经元存活的影响。【方法】野生型C57BL6小鼠随机分为2组:AAV-GFAP-GFP组和AAV-GFAP-ATG7组。分别于缺血半暗带区注射以上两种病毒,3周后待腺相关病毒感染稳定,建立MCAO/R模型。通过TTC染色检测各组动物脑梗死容积;通过免疫荧光染色检测神经元的存活。【结果】AAV-GFAP-ATG7上调星形胶质细胞自噬流水平减少脑缺血再灌注损伤后脑梗死容积并能增加神经元的存活(P<0.05)。【结论】上调星形胶质细胞自噬流水平在缺血性脑卒中病程中发挥神经保护作用。