【摘 要】
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发情是母猪繁殖活动的关键环节,依赖于卵巢卵泡的正常发育,卵泡颗粒细胞对卵泡发育和卵母细胞成熟具有重要的调控作用。环状RNA（circRNA）是一类在真核细胞中普遍存在的闭合环状结构的内源性RNA分子,可作为内源性竞争RNA（ceRNA）,通过吸附miRNA进而调控相关基因的表达。本研究是在前期对猪健康和闭锁卵泡的颗粒细胞转录组测序的基础上,对筛选的4个差异表达的circ-RB1、circSLC30
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发情是母猪繁殖活动的关键环节,依赖于卵巢卵泡的正常发育,卵泡颗粒细胞对卵泡发育和卵母细胞成熟具有重要的调控作用。环状RNA（circRNA）是一类在真核细胞中普遍存在的闭合环状结构的内源性RNA分子,可作为内源性竞争RNA（ceRNA）,通过吸附miRNA进而调控相关基因的表达。本研究是在前期对猪健康和闭锁卵泡的颗粒细胞转录组测序的基础上,对筛选的4个差异表达的circ-RB1、circSLC30A7、circ-ANGPT1、circ-ANKHD1进行成环验证。并重点探究circ-ANKHD1的差异表达及其对猪卵泡颗粒细胞增殖的影响。首先,通过RT-PCR进行circ-ANKHD1成环验证。结果显示ANKHD1基因可以转录产生circ-ANKHD1,由第二外显子到第七外显子环化而成,成环结合位点为GG,全长共936bp。通过q PCR检测circ-ANKHD1的成环效率,发现在原代卵泡颗粒细胞中circ-ANKHD1的表达丰度极显著低于线性ANKHD1基因的表达丰度（P＜0.01）。其次,通过q PCR检测circ-ANKHD1在不同大小卵泡、不同年龄母猪卵巢中的表达差异,发现在5-6mm卵泡中表达量最高、1-2mm卵泡次之、3-4mm卵泡最低,相互间均有差异显著（P＜0.01）。17月龄猪卵巢中circ-ANKHD1表达量极显著高于1日龄猪卵巢表达量（P＜0.01）。通过软件RegRNA2.0预测发现miR-34a-5p、miR-486-5p、miR-424-5P、miR-142-5p、miR-143-5p均是circ-ANKHD1的潜在靶miRNAs。然后,构建包含circ-ANKHD1全长序列的双荧光素酶表达载体psi CHECK-2-circ ANKHD1,在293FT细胞上验证circANKHD1与潜在miRNAs的结合情况。发现与NC组相比,转染miR-27a-3p及miR-142-5p mimic均能显著降低psi CHECK-2-circ ANKHD1的海参荧光素酶表达水平（P＜0.05）,表明circ-ANKHD1可以吸附miR-27a-3p和miR-142-5p。通过Targetscan软件预测发现SFRP1是miR-27a-3p的潜在靶基因。构建pc DNA3.1-circ ANKHD1过表达载体,分别转染猪颗粒细胞、293FT、猪PK肾细胞,通过q PCR验证其过表达效果以及对细胞增殖相关基因表达的影响。发现过表达circANKHD1可以使猪肾细胞中cyclin D1、p CNA、caspase3基因表达水平显著升高（P＜0.01）,p53基因表达水平极显著下降（P＜0.01）。同时研究发现过表达circANKHD1可以显著提高SFRP1基因表达水平,而转染miR-27a-3p mimics则极显著降低SFRP1基因的表达水平（P＜0.01）。表明circ-ANKHD1能够通过吸附miR-27a-3p而释放其对SFRP1基因表达的抑制作用,使SFRP1表达水平升高,进而调控细胞的增殖。
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