论文部分内容阅读
研究背景多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme,GBM）是脑部最常见肿瘤,占所有原发性脑实体瘤的45～50%。GBM呈浸润性增长,手术很难完全将肿瘤切除,且术后治疗较易出现耐药反应,很容易复发。替莫唑胺（temozolomide,TMZ）是GBM治疗的一线标准药物,能够提高GBM患者的预后。然而,大多数患者最终会发展为TMZ耐药,导致肿瘤复发。即使采用外科手术联合术后放化疗方案,患者平均中位生存时间只有约15个月,患者5年生存率不足10%。因此,阐明TMZ耐药机制并发现新的治疗靶标对于提高GBM治疗效果具有非常重要的价值。长链非编码RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）是没有或只具有低蛋白质编码能力的非编码RNA,其长度超过200 nt。大量研究表明,lncRNAs通过各种方式在胶质瘤TMZ耐药中发挥重要作用。Lnc RNAs与有氧糖酵解有关,有氧糖酵解是肿瘤耐药的重要原因。那么,lncRNA调控的胶质瘤TMZ耐药与有氧糖酵解是否有关呢?目前文献报道较少。研究目的本研究使用复发性GBM（recurrent glioblastoma multiforme,r GBM）和原发性GBM（primary glioblastoma multiforme,p GBM）肿瘤组织标本进行了全转录组测序（whole transcriptome sequencing,WTS）,通过包括差异表达基因、KEGG与GSEA功能分析等生物信息学分析及体外实验验证以筛选和鉴定在GBM复发中发挥关键作用的目标lncRNA分子。然后,通过一系列体内外实验鉴定关键lncRNA在GBM TMZ获得性耐药中的功能及作用机制,为GBM治疗提供潜在的治疗靶标。研究方法（1）目标mRNA和lncRNA分子的筛选和鉴定:本研究对3例r GBM和3例p GBM肿瘤组织进行WTS,生信分析筛选差异表达m RNAs,KEGG、GSEA分析m RNAs功能,CGGA数据库分析HSPA1A与GBM预后关系,q RT-PCR、Western blot检测HSPA1A在r GBM中的表达量,确定待研究的目标m RNA-HSPA1A;构建以HSPA1A为靶基因的差异9倍以上的lncRNAs与mi RNAs及HSPA1A形成的ce RNAs网络,q RT-PCR检测lncRNAs在r GBM中的表达量,Pearson相关性分析分析lncRNAs与HSPA1A表达量相关性,确定待研究的目标lncRNA。（2）目标lncRNA对HSPA1A表达及GBM细胞TMZ耐药特性的影响研究:TMZ持续刺激GBM细胞（U251Ctrl,GBM-LCtrl）建立耐TMZ GBM细胞株（U251TR,GBMLTR）;q RT-PCR、IF、Western blot检测HSP1A1A在耐TMZ GBM细胞中的表达量;q RT-PCR、FISH检测lnc AGTR在耐TMZ GBM细胞中的表达量及细胞定位;敲低耐TMZ细胞（U251TR,GBM-LTR）中lnc AGTR表达量,过表达亲本细胞（U251Ctrl,GBMLCtrl）中lnc AGTR表达量,Western blot检测HSPA1A表达量变化,CCK8检测GBM细胞耐TMZ特性。（3）目标lncRNA对GBM细胞增殖和有氧糖酵解的影响研究:敲低耐TMZ细胞（U251TR,GBM-LTR）中lnc AGTR表达量,过表达亲本细胞（U251Ctrl,GBM-LCtrl）中lnc AGTR表达量,Western blot检测ERK、AKT表达量;CCK8、克隆形成能力检测GBM细胞增殖能力,FCM检测细胞周期、凋亡;使用葡萄糖检测试剂盒检测细胞糖消耗,使用乳酸检测试剂盒检测细胞乳酸产生量;q RT-PCR检测有氧糖酵解关键分子（HIF-1α、HK2、LDHA、LDHB、PDK1、PKM2、GLUT1、GLUT4）表达变化;Western blot检测STAT3表达量。（4）目标lncRNA引起GBM细胞功能发生变化的机制研究:构建lnc AGTRmi RNAs-HSPA1A形成的竞争性内源性RNAs（competing endogenous RNAs,ce RNA）网络;双荧光素酶、RIP鉴定lnc AGTR与mi RNAs预测结合位点。（5）目标lncRNA对GBM细胞体内增殖的影响研究:构建GBM细胞小鼠皮下移植肿瘤模型;靶向lnc AGTR,检测肿瘤体积鉴定GBM细胞小鼠体内增殖情况;q RT-PCR检测lnc AGTR、HSPA1A表达量;IHC检测ki67分子表达量。结果（1）与pGBM相比,HSPA1A是r GBM中差异表达倍数最大的上调基因,功能分析显示与MAPK通路有关;11个差异表达超过9倍的lncRNAs可以与HSPA1A形成ce RNAs网络;3个lncRNAs在r GBM中高表达;鉴定了1个与HSPA1A表达相关性最高的lncRNA,命名为lnc AGTR（lncRNA activated in GBM with TMZ resistance,lnc AGTR）。（2）成功构建了对TMZ耐药的GBM细胞株;HSP1A1A、lnc AGTR在GBM耐药细胞株中均高表达,且lnc AGTR主要定位于细胞质内;Lnc AGTR可调控HSPA1A的表达量,且与GBM细胞耐TMZ特性有关。（3）研究结果显示上调lnc AGTR能够激活ERK、AKT信号通路,调控细胞周期,促进细胞增殖;同时上调lnc AGTR能够激活STAT3信号通路,增加丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2,PKM2）表达量,促进GBM细胞有氧糖酵解发生。而敲低细胞中lnc AGTR的表达水平,则得到了相反的结果。（4）LncAGTR通过竞争性结合hsa-mi R-10401-3p上调HSPA1A表达。（5）靶向lncAGTR能够抑制小鼠体内胶质瘤生长,肿瘤组织中lnc AGTR、HSPA1A表达量均降低,病理分析显示符合胶质瘤特征,且Ki67表达量降低。结论LncAGTR可能通过作用于hsa-miR-10401-3p/HSPA1A轴激活ERK、AKT和STAT3信号通路,进而促进细胞增殖,提高有氧糖酵解,导致GBM对TMZ耐药和复发。Lnc AGTR很有可能作为TMZ耐药的预测因子和治疗靶点。